Restriktionsenzymer fungerer, virkningsmekanisme, typer og eksempler



den restriktionsenzymer de er endonukleaser, der anvendes af visse arkæer og bakterier til at hæmme eller "begrænse" spredningen af ​​vira inde i dem. De er især almindelige i bakterier og er en del af deres forsvarssystem mod fremmed DNA kendt som restriktion / modifikationssystemet.

Disse enzymer katalyserer skæringen af ​​dobbeltstrenget DNA på specifikke steder, reproducerbart og uden brug af yderligere energi. De fleste kræver tilstedeværelsen af ​​cofaktorer såsom magnesium eller andre divalente kationer, selvom nogle også kræver ATP eller S-adenosylmethionin.

Restriktionsendonukleaser blev opdaget i 1978 af Daniel Nathans, Werner Arber og Hamilton Smith, som modtog Nobelprisen i medicin for sin opdagelse. Navnet stammer normalt fra organismen, hvor de observeres for første gang.

Sådanne enzymer anvendes i vid udstrækning i udviklingen af ​​DNA-kloningsmetoder og andre molekylærbiologiske og genetiske strategier. Dens karakteristika ved anerkendelse af specifikke sekvenser og evne til at skære sekvenser tæt på genkendelsessteder gør dem kraftfulde værktøjer i genetisk eksperimentering.

De fragmenter, der genereres af restriktionsenzymerne, der har handlet på et bestemt DNA-molekyle, kan anvendes til at genskabe et "kort" af det oprindelige molekyle ved at anvende information om de steder, hvor enzymet skærer DNA'et.

Nogle restriktionsenzymer kan have det samme genkendelsessted i DNA, men de skærer ikke nødvendigvis det på samme måde. Således er der enzymer, der gør udskæringer frafaldende endeløse ender og enzymer, der skærer ud af sammenhængende ender, som har forskellige anvendelser inden for molekylærbiologi.

I øjeblikket findes der hundredvis af forskellige kommercielt tilgængelige restriktionsenzymer, der tilbydes af forskellige kommercielle huse; disse enzymer fungerer som "brugerdefinerede" molekylære sakse til forskellige formål.

indeks

  • 1 funktioner
  • 2 Handlingsmekanisme
  • 3 typer
    • 3.1 Type I restriktionsenzymer
    • 3.2 Type II restriktionsenzymer
    • 3.3 Type III restriktionsenzymer
    • 3.4 Type IV restriktionsenzymer
    • 3,5 Type V restriktionsenzymer
  • 4 eksempler
  • 5 referencer

funktioner

Restriktionsenzymer tjener den modsatte funktion af polymeraser, da de hydrolyserer eller bryder esterbindingen inden i phosphodiesterbindingen mellem tilstødende nukleotider i en nukleotidkæde.

I molekylærbiologi og genteknologi er de almindeligt anvendte værktøjer til konstruktion af ekspressions- og kloningsvektorer såvel som til identifikation af specifikke sekvenser. De er også nyttige til konstruktion af rekombinante genomer og har et stort bioteknologisk potentiale.

Nylige fremskridt inden for genterapi gør nuværende anvendelse af restriktionsenzymer til indføring af visse gener i vektorer, der er vehikler til transport af sådanne gener til levende celler, og det har sandsynligvis evnen til at blive indsat i cellegenomet for at udføre permanente ændringer.

Handlingsmekanisme

Restriktionsenzymer kan katalysere opskæringen af ​​dobbeltstrenget DNA, selv om nogle er i stand til at genkende enkeltstrengede DNA-sekvenser og endda RNA. Klippet sker efter genkendelse af sekvenserne.

Virkningsmekanismen består i hydrolysen af ​​phosphodiesterbindingen mellem en phosphatgruppe og en deoxyribose i rygraden i hver DNA-streng. Mange af enzymerne kan skære på samme sted, som de genkender, mens andre skærer mellem 5 og 9 par baser før eller efter det..

Normalt disse enzymer skærer ved 5'-enden phosphatgruppe, resulterende DNA-fragmenter med en phosphoryl- 5'-enden og et hydroxyltal ende 3 'terminal.

Da proteinerne ikke kommer i direkte kontakt med genkendelsesstedet i DNA, skal de translokeres successivt, indtil de når det specifikke sted, måske ved hjælp af "glidende" mekanismer på DNA-strengen..

Under det enzymatiske snit placeres phosphodiesterbindingen af ​​hver af DNA-strengene i et af de aktive steder i restriktionsenzymerne. Når enzymet forlader genkendelses- og skæreområdet, gør det det gennem ikke-specifikke forbigående foreninger.

typen

I øjeblikket er fem typer restriktionsenzymer kendt. Nedenfor en kort beskrivelse af hver:

Type I restriktionsenzymer

Disse enzymer er store pentameriske proteiner med tre underenheder, en restriktion, en methylering og en anden til genkendelse af sekvenser i DNA. Disse endonucleaser er multifunktionelle proteiner, der er i stand til at katalysere restriktions- og modifikationsreaktioner, de har ATPase-aktivitet og også DNA-topoisomerase.

Enzymer af denne type var den første til at blive opdaget endonukleaser, oprenset for første gang i 1960'erne og er siden blevet undersøgt i dybden.

Type I-enzymer anvendes ikke i vid udstrækning som et bioteknologisk værktøj, da skæringsstedet kan have en variabel afstand på op til 1.000 basepar fra genkendelsesstedet, hvilket gør dem upålidelige med hensyn til eksperimentel reproducerbarhed.

Type II restriktionsenzymer

De er enzymer sammensat af homodimerer eller tetramerer, der skærer DNA på bestemte steder mellem 4 og 8 bp i længden. Disse skæringssteder er typisk palindromiske, det vil sige, de genkender sekvenser, der læses på samme måde i begge retninger.

Mange af type II-restriktionsenzymerne i bakterier skærer DNA, når de genkender deres fremmede karakter, da de ikke besidder de typiske modifikationer, som eget DNA burde have..

Disse er enzymer enklere begrænsning som cofaktor kræver ikke andet end magnesium (Mg +), anerkender og skære DNA-sekvenser.

Nøjagtigheden af ​​type II-restriktionsenzymer ved genkendelse og skæring af simple sekvenser i DNA i præcise positioner gør dem til en af ​​de mest anvendte og uundværlige i de fleste grene af molekylærbiologi.

Inden for gruppen af ​​type II er restriktionsenzymer flere underklasser klassificeret ifølge visse egenskaber, som er unikke for hver enkelt. Klassificeringen af ​​disse enzymer sker ved at tilføje bogstaver i alfabetet, fra A til Z efter enzymmets navn.

Nogle af de undergrupper, der er mest kendt for deres anvendelighed er:

Underklasse IIA

De er dimere af forskellige underenheder. De genkender asymmetriske sekvenser og anvendes som ideelle forstadier til generering af skærende enzymer.

Underklasse IIB

De er sammensat af endnu en dimer og skærer DNA'et på begge sider af genkendelsessekvensen. De skærer begge strenge af DNA i en række basepar ud over genkendelsesstedet.

Underklasse IIC

Enzymer af denne type er polypeptider med funktioner af opdeling og modifikation af DNA-tråde. Disse enzymer skærer begge strenge asymmetrisk.

Underklasse IIE

Enzymerne i denne underklasse er de mest anvendte inden for genteknologi. De har et katalytisk sted og kræver generelt en allosterisk effektor. Disse enzymer behøver at interagere med to kopier af deres genkendelsessekvens for at opnå en effektiv nedskæring. Inden for denne underklasse er enzymerne EcoRII og EcoRI.

Type III restriktionsenzymer

Type III restriktionsendonucleaser er sammensat af kun to underenheder, den ene er ansvarlig for DNA-genkendelse og modifikation, mens den anden er ansvarlig for at skære sekvensen.

Disse enzymer kræver to cofaktorer for deres funktion: ATP og magnesium. Restriktionsenzymer af denne type besidder to asymmetriske genkendelsessteder, translaterer DNA'et på en ATP-afhængig måde og skærer det mellem 20 og 30 bp ved siden af ​​genkendelsesstedet..

Type IV restriktionsenzymer

Type IV enzymer er nemme at identificere, da de skærer DNA med methyleringsmærker, de består af flere forskellige underenheder, der er ansvarlige for genkendelse og skæring af DNA-sekvensen. Disse enzymer bruger som cofaktorer GTP og divalent magnesium.

Specifikke steder til skæring omfatter nukleotidkæder med rester af methyleret eller hydroxymethyleret cytosin i en eller begge nukleinsyrer.

Type V restriktionsenzymer

Denne klassificering grupperer enzymerne CRISPER-Cas-typen, som identificerer og skærer specifikke DNA-sekvenser fra invaderende organismer. Cas enzymer bruger en streng af CRISPER syntetiseret styrende RNA til at genkende og angribe invaderende organismer.

Enzymer klassificeret som type V er polypeptider struktureret af type I, II og II enzymer. De kan klippe dele af DNA'et fra næsten enhver organisme og med en stor rækkevidde. Deres fleksibilitet og brugervenlighed gør disse enzymer til et af de mest anvendte værktøjer inden for genteknologi i dag sammen med type II enzymer.

eksempler

Restriktionsenzymer er blevet anvendt til påvisning af DNA-polymorfier, især i undersøgelser af populationsgenetik og evolutionære undersøgelser ved anvendelse af mitokondrie-DNA, for at opnå information om hastigheden af ​​nukleotidsubstitutioner..

På nuværende tidspunkt findes vektorer, som anvendes til transformation af bakterier med forskellige formål, med multikloningssteder, hvor der findes genkendelsessteder for multiple restriktionsenzymer..

Blandt disse enzymer er de mest populære EcoRI, II, III, IV og V, opnået og beskrevet for første gang E. coli; HindIII, fra H. influenzae og BamHI's B. amyloliquefaciens.

referencer

  1. Bickle, T. A., & Kruger, D. H. (1993). Biologi af DNA-begrænsning. Mikrobiologiske anmeldelser, 57(2), 434-450.
  2. Boyaval, P., Moineau, S., Romero, D. A., & Horvath, P. (2007). CRISPR Tilbyder modstand mod virus i prokaryoter. Videnskab, 315(Marts), 1709-1713.
  3. Goodsell, D. (2002). Det molekylære perspektiv: Restriktionsendonukleaser. Stamceller grundlaget for kræftmedicin, 20, 190-191.
  4. Halford, S. E. (2001). Hopping, hoppe og looping med restriktionsenzymer. Transaktioner med biokemiske samfund, 29, 363-373.
  5. Jeltsch, A. (2003). Vedligeholdelse af artidentitet og styring af bakterierespecifikation: En ny funktion til begrænsnings- / modifikationssystemer? gen, 317, 13-16.
  6. Krebs, J., Goldstein, E., & Kilpatrick, S. (2018). Lewins gener XII (12 udg.). Burlington, Massachusetts: Jones & Bartlett Learning.
  7. Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N., ... She, Q. (2015). Harnessing Type I og Type III CRISPR-Cas systemer til genom redigering. Nucleic Acids Research, 1-12.
  8. Loenen, W. A.M., Dryden, D.T. F., Raleigh, E.A., & Wilson, G.G. (2013). Type I restriktionsenzymer og deres slægtninge. Nucleic Acids Research, 1-25.
  9.  Nathans, D., & Smith, H. O. (1975). Restriktionsendonukleaser i analysen og omstruktureringen af ​​DNA-molekyler. Annu. Rev. Biochem., 273-293.
  10.  Nei, M., & Tajima, F. (1981). DNA-polymorfisme detekterbar ved restriktionsendonukleaser. Genetik, 145-163.
  11.  Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). Cellular and Molecular Life Sciences Type II restriktionsendonukleaser: struktur og mekanisme. CMLS Cellular and Molecular Life Sciences, 62, 685-707.
  12.  Roberts, R. (2005). Hvordan restriktionsenzymer blev arbejdsheste i molekylærbiologi. PNAS, 102(17), 5905-5908.
  13.  Roberts, R.J., & Murray, K. (1976). Restriktionsendonukleaser. Kritiske anmeldelser i biokemi, (November), 123-164.
  14.  Stoddard, B. L. (2005). Homing endonuclease struktur og funktion. Kvartalsvise anmeldelser af biofysik, 1-47.
  15.  Tock, M. R., & Dryden, D. T. F. (2005). Biologi af restriktion og anti-begrænsning. Nuværende udtalelse i mikrobiologi, 8, 466-472. https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.06.003
  16.  Wilson, G.G., & Murray, N.E. (1991). Restriktion og modifikationssystemer. Annu. Rev. Genet., 25, 585-627.
  17.  Wu, Z., & Mou, K. (2016). Genomisk indsigt i Campylobacter jejuni virulens og populationsgenetik. Inficere. Dis. Oversat. Med., 2(3), 109-119.
  18.  Yuan, R. (1981). Struktur og mekanisme for multifunktionelle restriktionsendonukleaser. Annu. Rev. Biochem., 50, 285-315.