Urea bouillon fundament, forberedelse og anvendelser

den urea bouillon er et flydende dyrkningsmedium, der anvendes til at påvise tilstedeværelsen af ​​enzymet urease i visse mikroorganismer. Urease er et mikrobielt enzym, der produceres konstitutivt, det vil sige det syntetiseres uafhængigt af om substratet, på hvilket det virker, er til stede.

Funktionen af ​​urease er relateret til nedbrydning af organiske forbindelser. Ikke alle mikroorganismer er i stand til at syntetisere dette enzym, derfor gør dets bestemmelse i laboratoriet det muligt at identificere bestemte bakteriestammer og endda differentiere mellem arter af samme slægt..

Der er to typer urinstofprøve: Stuart og Christensen. De adskiller sig i deres sammensætning og følsomhed. Den første er speciel til at vise en stor mængde urease produceret af arter af slægten Proteus.

Den anden er mere følsom og kan påvise små mængder af urease sent genereret af andre bakterielle, såsom Klebsiella, Enterobacter, Staphylococcus, Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus, og Helicobacter slægterne Mycobacterium.

Stuart bouillon urinstof omfatter urea, natriumchlorid, dikaliumphosphat, monokaliumphosphat, gærekstrakt, phenolrødt og destilleret vand.

Mens, mediet eller Christensens urinstof agar består af pepton, natriumchlorid, monokaliumphosphat, glucose, urinstof, phenolrødt, destilleret vand og agar. Sidstnævnte kun hvis det er det faste medium.

indeks

• 1 Foundation
  • 1,1 Stuart urea bouillon
  • 1.2 Christensen bouillon eller agar urinstof
  • 1.3 Fortolkning af begge medier (Stuart og Christensen)
• 2 Fremstilling
  • 2.1 Stuart urea bouillon
  • 2.2 Christensen bouillon eller agar urinstof
• 3 anvendelser
• 4 Såning af urinstofprøven
• 5 Kvalitetskontrol
• 6 referencer

fundament

Enzym ureasen hydrolyserer urinstof til dannelse af carbondioxid, vand og to molekyler ammoniak. Disse forbindelser reagerer til dannelse af det endelige produkt kaldet ammoniumcarbonat.

Stuart urea bouillon

Stuart urea-bouillon er mere bufferet med en pH på 6,8. Derfor skal mikroorganismen være i stand til at danne store mængder ammonium for at blive rød til phenol. PH skal stige over 8.

Derfor urinstof bouillon er selektiv for Stuart Proteus, hvilket gav positive resultater i 24 til 48 timers inkubation, og er ikke effektivt for bakterier, som producerer små mængder af urease eller langsomt hydrolyserer urinstof.

Dette skyldes, at Proteus-arter er i stand til at anvende urinstof som nitrogenkilde. I modsætning hertil behøver andre ureaseproducerende bakterier en yderligere kilde.

Pérez et al. (2002) bestemt, at urinstof bouillon Stuart var så effektiv som Christensens urea agar for at bestemme urease i gærstammer af slægterne Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon og Saccharomyces.

Forfatterne af undersøgelsen hævder at have opnået 100% sammenfald med begge medier (Stuart og Christensen) ved inkubering i 24 og 48 timer; forudsat at de tog så positivt de stammer, der formåede at vende mediet til en stærk pink-fuchsia farve.

Denne præcisering er nødvendig, da Lodder (1970) bekræftede, at næsten alle gærene klarer at placere skarpheden af ​​urinstofagar fra Christensen til lysrosa. Dette skyldes, at de kan hydrolyse urinstof i minimale mængder og til dannelsen af ​​aminer ved den oxidative dekarboxylering af aminosyrerne på overfladen. Dette bør ikke fortolkes som positivt.

Bouillon eller urinstof agar fra Christensen

Christensen urea bouillon eller agar er mindre pufret, er i stand til at detektere små mængder ammonium. Derudover er dette medium beriget med peptoner og glucose. Disse forbindelser forårsager andre ureaseproducerende mikroorganismer, som ikke vokser i Stuart-bouillon til udvikling.

Ligeledes giver Christensen urea test hurtigere resultater, især for Proteus, at kunne give stærk positiv på så lidt som 30 minutter som minimum tid og op til 6 timer som maksimal tid.

Resten af ​​urease-producerende mikroorganismer opnå farve halvdel dreje let efter 6 timer, og stærkt ved 24, 48, 72 timer eller mere, og endda nogle stammer kan give svage reaktioner efter 5 eller 6 dage.

Fortolkning af begge medier (Stuart og Christensen)

Mediet er oprindelig gul-orange i farve, og en positiv reaktion vil ændre mediumets farve til pink-fuchsia. Farvens intensitet er direkte proportional med mængden af ​​produceret ammonium.

En negativ reaktion vil forlade mediet af den oprindelige farve med undtagelse af gærene, som kan give en lysegrå med Christensen urea agar.

forberedelse

Stuart urea bouillon

Væg det nødvendige gram i henhold til indikationerne på det kommercielle hus. Opløs i fortrinsvis sterilt destilleret vand. Brug ikke varme til at opløse, fordi urea er følsom over for varme.

Membranfiltreringsmetoden anvendes til sterilisering. Til dette anvendes et Millipore filter med porer på 0,45 μ i diameter. Brug ikke en autoklav. Når opløsningen er filtreret, fordeles den i sterile rør. For at opnå pålidelige resultater skal det overføres mellem 1,5 ml som minimumsmængde til 3 ml som maksimumsmængde pr. Rør..

Opbevares i køleskab og temperament før brug.

Hvis filtreringsmetoden ikke er tilgængelig, skal mediet anvendes straks for at opnå pålidelige resultater.

En anden måde at forberede urea Stuart bouillon er som følger:

Nogle kommercielle huse sælger den halve base til urinstofprøven, uden urea.

Mængden angivet af det kommercielle hus er vejet. Den opløses i destilleret vand og steriliseres i autoklaven ved 121 ° C i 15 minutter. Lad det hvile lidt, og når mediet er varmt tilsættes 100 ml af en opløsning af urinstof fremstillet til 20% og steriliseret ved filtrering.

Den fordeles i sterile rør som tidligere beskrevet.

Bouillon eller urinstof agar fra Christensen

-Fremstilling af urinstofopløsningen

Væg 29 gram dehydreret urinstof og opløs i 100 ml destilleret vand. Brug filtreringsmetoden til at sterilisere. Autoklaver ikke.

-Urea base agar

Opløs 24 g af den dehydrerede baseagar i 950 ml destilleret vand. Steriliseres i autoklaven ved 121 ° C i 15 minutter. Lad stå, indtil den når en temperatur på 50 ° C, og tilsæt det tidligere fremstillede urinstof aseptisk.

Hæld 4 til 5 ml i sterile rør og vippe indtil størkning. Der skulle være en lang fløjtestop.

Dette medium kan også fremstilles i flydende form.

applikationer

Urea-testen er yderst effektiv til at skelne Proteus-slægten fra andre slægter fra Enterobacteriaceae-familien, givet den hurtige reaktion fra Proteus.

Hvis sammensætningen af ​​Christensen anvendes, hjælper testen med at skelne mellem arter af samme slægt. For eksempel, S. haemolyticus og S. warneri spå Staphylococcus coagulase negativ og betahemolytisk, men de adskiller sig i det S. hemolyticus det er negativt urea og S. warneri det er positivt urinstof.

På den anden side har McNulty med succes brugt 2% Christensen urea bouillon til at studere tilstedeværelsen af Helicobacter pylori i prøver af biopsier taget fra maveslimhinden (antralområdet).

Tilstedeværelsen af H. pylori det fremgår af en positiv urinstofprøve. Varigheden til at observere resultaterne er direkte proportional med mængden af ​​mikroorganismer til stede.

Som det kan ses, er det en simpel metode til diagnose af Helicobacter pylori i mavebiopsier.

Endelig er denne test også nyttig til at differentiere arter af slægterne Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus og Mycobacteria.

Såning af urinstofprøven

De to metoder kræver et stærkt mikrobielt inokulum for at optimere resultaterne. Bakteriekolonier tages fortrinsvis fra blodagar og Sabouraud-agar-gærer med nogle undtagelser. Inokulumet emulgeres i det flydende medium.

For Stuart urea-bouillon inkuberes ved 37 ° C i 24 til 48 timer, idet man ved, at man kun søger stammer af slægten Proteus, når stammen er en bakterie. For gær kan den inkuberes ved 37 ° C eller ved stuetemperatur i 24 til 48 timer inkubation.

I tilfælde af Christensen urea bouillon inkuberes ved 37 ° C i 24 timer. Hvis testen er negativ, kan den inkuberes i op til 6 dage. Hvis testen er positiv inden for 6 timer, indikerer den, at den er en stamme af slægten Proteus.

I tilfælde af Christensen urea-agar er agarskrådet yderst inokuleret uden punktering. Kødet er inkuberet og fortolket på samme måde.

Kvalitetskontrol

Kontrolstammer kan bruges til at teste mediet, f.eks Proteus mirabilis ATCC 43071, Klebsiella pneumoniae  ATCC 7006003, Escherichia coli ATCC 25922 og Salmonella typhimurium.  De to første skal give positive resultater og de sidste to negative resultater.

referencer

1. Pérez C, Goitía K., Mata S, Hartung C, Colella M, Reyes H. et al. Anvendelse af Stuart urea-bouillon til ureasetesten som en test i gærdiagnosen. Rev. Soc. Ven. Microbiol. 2002; 22 (2): 136-140. Tilgængelig på: Scielo.org.
2. Mac Faddin J. (2003). Biokemiske test til identifikation af bakterier af klinisk betydning. 3. ed. Editorial Panamericana. Buenos Aires Argentina.
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Mikrobiologisk diagnose af Bailey & Scott. 12 udg. Editorial Panamericana S.A. Argentina.
4. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnose. 5. udgave. Editorial Panamericana S.A. Argentina.
5. Laboratorier Britania. Christensen Medio (Urea agar base) 2015. Tilgængelig på: britanialab.com