Bakterielle udsmidningsegenskaber og forberedelse

den bakteriel udstrygning er en forlængelse i form af en tynd film af en suspension af bakterielle mikroorganismer, der udføres på en transparent glasplade eller dias, til observation under et optisk mikroskop.

Udvidelsen i form af film udføres for at adskille mikroorganismerne så meget som muligt, fordi hvis de er grupperet, er observationen ikke klar.

I undersøgelsen af ​​bakteriekulturer anvendes teknikker til smearpreparation, fiksering og farvning til at analysere dem bedre. På grund af mikroorganismens lille størrelse kræves det nødvendigt at anvende et optisk mikroskop til observation.

De optiske mikroskoper er uundværlige instrumenter til observation af udstødningerne. Disse bruger optiske linser og lys, der gør det muligt at visualisere prøverne med stor forøgelse i størrelse.

I almindelighed har levende celler ikke strukturer, der for det meste er farvede, set gennem det optiske mikroskop, de er farveløse, gennemsigtige prøver og viser meget lidt intern kontrast og med deres omgivelser.

Observationen med det enkle lysfeltmikroskop, uden brug af hjælpefarvningsteknikker, er meget begrænset og anvendes kun i nogle tilfælde som i observationen af ​​bevægelsen af ​​mikroorganismer.

For at observere mikroorganismer optimalt skal der opnås en balance mellem kontrast og opløsning. Detaljerne af cellerne kan ikke observeres under et mikroskop, selv ved høj opløsning; brug af farvestoffer er påkrævet ved farvningsteknikker, som giver kontrast til observation.

indeks

• 1 Karakteristik af en god kvalitet bakteriel udstrygning
  • 1.1 Fremragende kontrast
  • 1.2 God løsning
  • 1.3 God farvning
• 2 Fremstilling
  • 2.1 A. Frotis
  • 2.2 B. Fastgørelse
  • 2.3 C. Enkel farvning
  • 2.4 D. Endelig opbevaring af smøret
• 3 referencer

Karakteristik af en god kvalitet bakteriel smear

Fremragende kontrast

For at opnå en fremragende kontrast kaldes sofistikerede mikroskoper fasekontrastmikroskop, differentialinterferens og mørkt feltmikroskop. Denne type mikroskop anvendes til at observere bakterielle strukturer som f.eks. Skeder og filamenter.

Farvning er en simpel teknik til at øge den kontrast, der opnås med et klart feltmikroskop. I denne teknik kan forskellige farvestoffer anvendes, som mærkbart forbedrer observationen under mikroskopet.

Pletterne fremstilles direkte på udtværingerne eller forlængelserne af suspensioner af mikroorganismer på gliderne, der tidligere er tørret og fikseret.

God løsning

Fastgørelse er en teknik, der bruges til at bevare cellulære strukturer; forårsager inaktivering af mikroorganismerne og adhæsion til glidens glas. Der er forskellige fikseringsbehandlinger: varmefiksering og kemisk fixering.

Varmefiksering

Dette er den metode, der er mest anvendt ved observation af bakteriel udtværing. Teknikken består i at passere bakteriens suspension af smøret ved en lighters flamme. Denne teknik er i stand til at bevare bakteriens ydre morfologi, men ødelægger deres indre strukturer.

Kemisk fixering

Kemisk fixering bruger kemikalier til konservering, såsom formaldehyd eller formaldehyd, ethanol og eddikesyre. Fordelen ved at anvende kemiske fastgørelsesmidler er, at bevarelsen af ​​mikroorganismernes interne cellulære strukturer opnås.

God farvning

De mest almindelige procedurer til farvning af et tidligere tørret og fast smear er positiv eller enkel farvning, differentiel farvning og negativ farvning. Der er også særlige teknikker til farvning af bestemte cellestrukturer (kapsel, spore, flagella).

Positiv farvning eller simpel farvning

Positiv eller enkel farvning er den mest anvendte pletfleksteknik. Bruger farvestoffer, der har evnen til at binde sig til bestemte mikrobielle strukturer, så de kan observeres under et mikroskop.

Disse farvestoffer har chromophoriske grupper (farvet portion) i deres kemiske struktur med vekslende dobbeltbindinger og simple bindinger (konjugation). Disse bindinger kan igen oprette ioniske eller kovalente bindinger med nogle cellulære strukturer.

De farvestoffer, der anvendes i positiv eller enkel farvning, er for det meste kemiske derivater af anilin (farvede organiske salte).

På den anden side kan vi blandt farvestoffer finde nogle med basisk pH og andre med sur pH.

Grundlæggende farvestoffer

I basiske farvestoffer har chromophore-gruppen en positiv elektrisk ladning. Langt de fleste prokaryote mikroorganismer har en neutral intern pH, og deres celleoverflade er negativt ladet. Gennem denne elektrostatiske interaktion binder chromoforen sig til cellen og farvestoffer den.

Eksempler på basiske farvestoffer er methylenblåt, violet krystal, malachitgrøn, basisfuscin, safranin, blandt andre.

Sure farvestoffer

I sure farvestoffer har chromophore-gruppen en negativ elektrisk ladning. Disse anvendes til farvning af proteiner med positivt ladede aminogrupper. Eksempler på sure farvestoffer er syrefuscin, rose Bengal, Congo rød og eosin.

Differentiel farvning

Teknikken med differentiel farvning består i at anvende to farvestoffer af forskellig farve eller intensitet til at skelne forskellige mikroorganismer under mikroskopet. Gram plet og syre-alkohol resistens farvning er de mest anvendte differentierede pletter i bakteriologi.

Gramfarvning anvendes som en foreløbig test for at kende formen, størrelsen, cellegrupperingen, ud over typen af ​​cellevæg. Gennem Gram stain-testen klassificeres bakterier med cellevæg som Gram-positive bakterier og Gram-negative bakterier.

Negativ farvning

I denne teknik anvendes kemiske farvestoffer, der ikke trænger ind i det cellulære indre, men de gør det medium, hvor mikroorganismerne fremstår som en sort baggrund.

Ved teknikken med negativ farvning fremstilles smøret med en dråbe suspension af kinesisk blæk eller nigrosin, som efter at have tilladt tørring ved stuetemperatur danner en film, der er uigennemsigtig over for lysets passage. På denne måde observeres mikroorganismer som lyse former på en mørk baggrund.

forberedelse

A. Smøre

1. Vask gliderne godt, tør med absorberende papir og mærk dem. Mærket skal angive indholdet af præparatet, dato og navn på den person, der behandlede det.

2.- Lys lighteren og steriliser inokulationssløjfen i flammen, indtil den er rød, varm.

3.- Lad håndtaget afkøles.

4. Tag røret af bakteriekulturen, fjern hætten og hurtigt passere rørets mund i nærheden af ​​lygterens flamme (flamme).

5.- Indfør inokuleringssløjfen inde i røret, der indeholder bakteriekulturen, og tag prøven.

6.- Hvis kulturen er i flydende medium, skal prøven tages med håndtaget i midten af ​​lysbilledet og spredes forsigtigt i en cirkel med en diameter på ca. 2 cm.

7.- Re-steriliser inokulationssløjfen.

8.- Tillad tørring af smøret i luften.

9. Gentag trin 3 til 8 tre gange.

10.- Hvis kulturen er i fast medium, skal en dråbe destilleret vand tidligere placeres på glideren. Dette gøres for at blande en lille prøve af kulturen taget med inokulationshåndtaget ifølge indikationerne i trin 2 til 5 (asepsisbetingelser).

11.- Udvid den fortyndede prøve med vanddråbet på diaset og gentag tre gange.

B. Fastgørelse

1.- Tilføj til de tørre udstødninger - produceret fra kulturer i flydende medium, to dråber methanol eller absolut ethanol.

2.- Tillad tørring i luften væk fra lighteren.

3.- Hvis smøret kommer fra en kultur i fast medium, er det tørre smøre fastgjort med varme og passerer det 2 til 3 gange hurtigt gennem det varmeste område af lygterens flamme.

4.- Berør undersiden af ​​smøret med den dorsale del af venstre hånd (til højrehåndet, ellers brug højre hånd) og kontroller, at det er koldt.

C. Enkel farvning

1.- Tilsæt 2 dråber af det valgte farvestof til smøret og lad det fungere i den tid, der kræves i de specifikke protokoller for hvert farvestof (normalt mellem 1 og 5 minutter).

2. Nogle farvestoffer kræver anvendelse af varme til aktivering, i hvilket tilfælde der skal være meget omhyggelig, når opvarmning af glideren i brænderflammen (behandling med en pincet for at forhindre kogning). Smør overophedning kan ødelægge de celler, som du ønsker at observere.

3. Fjern overskydende farvestof ved at vaske med destilleret vand fra en picette. Fjern vaskevandet ved forsigtigt at trykke glideren på sin kant, vippes på arbejdsbordet.

4.- Tillad lufttørring.

5.- Afhængigt af typen af ​​observation anvendes et dækslip eller ikke i dette trin. Dækglaset beskytter og bevarer smeden. Hvis der observeres ved nedsænkning i olie på dette stadium, anvendes der ingen dækglas, men smeden kan ikke bevares.

D. Endelig opbevaring af smøret

1.- Sænk smøret successivt i hver af nedenstående løsninger, i mindst 5 minutter. Formålet med disse "bade" er at lade smøret blive helt dehydreret. Hvert reagens skal drænes, før smøringen introduceres i det næste bad.

Ordren for dehydreringsbadene er som følger:

1. Ethanol 70%
2. 95% ethanol
3. Ren acetone
4. Bland acetone-xylol 1: 1
5. xylen

Tillad derefter lufttørring.

2.- Monter dækslet, fortrinsvis 22 × 22 mm, ved hjælp af canadisk balsam eller andre monteringsmidler.

referencer

1. Briggs, G. (1965). Årsagssygdomme i mikrobiologiske laboratorieulykker og infektioner. US Army Biological Laboratories. Fort Detrick.
2. Cappucino, J.G. og Welch, C.T. (2017). Mikrobiologi: En laboratoriehåndbog. Pearson.
3. Holt, J.G. Editor. (1977). Den kortere Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. 8^th Baltimore: Williams og Wilkins Co.
4. Johnson, T.R. og sag; C.L. (2018). Laboratorieforsøg i mikrobiologi. Pearson.
5. Tille, P. (2017). Diagnostisk mikrobiologi. 14^th St. Louis, USA: Elsiever, Inc.