DNA mikroarrays i, hvad det består, procedure og applikationer



en DNA microarray, Også kaldet DNA chip eller DNA microarray, den består af en række DNA fragmenter forankret til en fysisk understøttelse af variabelt materiale, enten plast eller glas. Hvert stykke DNA repræsenterer en sekvens komplementær til et specifikt gen.

Hovedmålet med mikroarrays er den komparative undersøgelse af udtrykket af visse gener af interesse. For eksempel er det almindeligt, at denne teknik anvendes på to prøver - en under sunde betingelser og en patologisk - for at identificere, hvilke gener der udtrykkes, og som ikke er i den prøve, der præsenterer tilstanden. Den nævnte prøve kan være en celle eller et væv.

Generelt kan generens ekspression detekteres og kvantificeres takket være anvendelsen af ​​fluorescerende molekyler. Manipulationen af ​​chipserne udføres i de fleste tilfælde af robot og et stort antal gener kan analyseres samtidigt.

Denne innovative teknologi er nyttig til en bred vifte af discipliner, fra medicinsk diagnostik til forskellige molekylærbiologiske studier inden for proteomik og genomik.

indeks

  • 1 Hvad består den af??
    • 1.1 Typer af mikroarray
  • 2 Procedure
    • 2.1 RNA isolation
    • 2.2 Produktion og mærkning af cDNA
    • 2.3 Hybridisering
    • 2.4 Systemaflæsning
  • 3 applikationer
    • 3.1 Kræft
    • 3.2 Andre sygdomme
  • 4 referencer

Hvad består det af??

DNA-mikroarrays (deoxyribonukleinsyre) er et sæt specifikke DNA-segmenter bundet til en fast matrix. Disse sekvenser er komplementære til de gener, der ønsker at blive studeret, og der kan være op til 10.000 gener pr. Cm2.

Disse egenskaber tillader en systematisk og massiv undersøgelse af genekspression af en organisme.

De oplysninger, som en celle har brug for til dens funktion, er kodet i enheder kaldet "gener". Visse gener indeholder instruktioner til oprettelse af essentielle biologiske molekyler kaldet proteiner.

Et gen udtrykkes, hvis dets DNA transkriberes til et intermediært molekyle af messenger-RNA, og ekspressionen af ​​genet kan variere afhængigt af niveauet af transkription af dette segment af DNA. I visse tilfælde kan ændringen i udtryk være tegn på sygdomme.

Hybridiseringsprincippet muliggør driften af ​​mikroarrayserne. DNA er et molekyle sammensat af fire typer nukleotider: adenin, thymin, guanin og cytosin.

For at danne den dobbelt spiralformede struktur grupperes adenin med thymin og cytosin med guanin. Således kan to komplementære kæder forbindes med hydrogenbindinger.

Typer af mikroarrays

Hvad angår strukturen af ​​microarrays der er to varianter: de specialfremstillede komplementære DNA eller oligonukleotid mikroanalyse og kommercielle høj densitet fremstillet af kommercielle virksomheder såsom Affymetrix GeneChip.

Den første type af microarray tillader analyse af RNA fra to forskellige prøver i en enkelt chip, mens den anden variation er af den kommercielle type og har et stort antal gener (f.eks Affymetrix GeneChip har omkring 12.000 humane gener), der tillader analyse en enkelt prøve.

proces

RNA isolation

Det første skridt til at udføre et eksperiment ved hjælp af microarray teknologi er isoleringen og rensningen af ​​RNA molekyler (kan være messenger RNA eller andre typer af RNA).

Hvis du vil sammenligne to prøver (sund og syg, kontrol mod behandling blandt andre), skal isolationen af ​​molekylet i begge væv gøres.

Produktion og mærkning af cDNA

Efterfølgende udsættes RNA for en fremgangsmåde med revers transkription i nærværelse af mærkede nukleotider, og således vil det komplementære DNA eller cDNA opnås..

Mærket kan være fluorescerende og skal differentieres mellem de to væv, som skal analyseres. De fluorescerende forbindelser Cy3 og Cy5 anvendes traditionelt, da de udsender fluorescens ved forskellige bølgelængder. I tilfælde af Cy3 er det en farve tæt på rødt og Cy5 svarer til spektret mellem orange og gul.

hybridisering

CDNA'er blandes og inkuberes snittene i mikromatrice at tillade hybridisering (dvs. binding forekommer) cDNA fra begge prøver med DNA-delen immobiliseret på den faste overflade af mikroarrayet.

En højere procentdel af hybridisering med sonden i mikroarrayet fortolkes som en større vævsekspression af det tilsvarende mRNA.

System læsning

Kvantifikationen af ​​udtrykket udføres ved at inkorporere et læsersystem, som tildeler en farvekode til mængden af ​​fluorescens udsendt af hvert cDNA. For eksempel, hvis rød er brugt til at markere den patologiske tilstand, og den hybridiserer i større proportioner, vil den røde komponent være den overvejende.

Med dette system er det muligt at kende overekspression eller undertrykkelse af hvert gen analyseret under begge valgte betingelser. Med andre ord kan du kende transkriptomet af de prøver, der blev evalueret i eksperimentet.

applikationer

I øjeblikket anses mikroarrays for at være meget kraftfulde værktøjer inden for medicin. Denne nye teknologi gør det muligt at diagnosticere sygdomme og en bedre forståelse af, hvordan genekspression ændres under forskellige medicinske forhold.

Derudover tillader det sammenligning af et kontrolvæv og et væv behandlet med et bestemt lægemiddel for at undersøge virkningerne af en mulig medicinsk behandling.

For at gøre dette sammenlignes den normale tilstand og den syge tilstand før og efter indgivelsen af ​​lægemidlet. Når man studerer lægemidlets virkning på genomet in vivo du har et bedre overblik over handlingsmekanismen af ​​det. Derudover kan det forstås, hvorfor nogle bestemte stoffer fører til uønskede bivirkninger.

kræft

Kræft tops listerne over sygdomme studeret med DNA mikroarrays. Denne metosologi er blevet anvendt til klassificering og prognose af sygdommen, især i tilfælde af leukæmi.

Feltet af undersøgelsen af ​​denne betingelse indebærer komprimering og karakterisering af den molekylære basis for cancerceller at finde mønstre af genekspression, som resulterer i fejl i reguleringen cellecyklus og celledødsprocesser (eller apoptose).

Andre sygdomme

Ved at bruge mikroarrays er blevet belyst den differentielle ekspression profiler af gener i medicinske tilstande af allergier, primære immundefekter, autoimmunsygdomme (såsom rheumatoid arthritis) og infektionssygdomme.

referencer

  1. Bednar, M. (2000). DNA microarray teknologi og applikation. Medical Science Monitor, 6(4), MT796-MT800.
  2. Kurella, M., Hsiao, L., Yoshida, T., Randall, J. D., Chow, G., Sarang, S., ... & Gullans, S. R. (2001). DNA mikroarray analyse af komplekse biologiske processer. Journal of the American Society of Nefrology, 12(5), 1072-1078.
  3. Nguyen, D. V., Bulak Arpat, A., Wang, N., & Carroll, R.J. (2002). DNA mikroarray eksperimenter: biologiske og teknologiske aspekter. Biometri, 58(4), 701-717.
  4. Plous, C. V. (2007). DNA mikroarrays og deres anvendelser inden for biomedicinsk forskning. CENIC Magazine. Biologiske videnskaber, 38(2), 132-135.
  5. Wiltgen, M. & Tilz, G. P. (2007). DNA mikroarray analyse: principper og klinisk påvirkning. Hæmatologi, 12(4), 271-287.