DNA sekventering Maxam-Gilbert, Sanger metode, eksempler



den DNA-sekventering (deoxyribonukleinsyre) er en procedure udført i molekylærbiologi laboratorier, der tillader kendskab til rækkefølgen af ​​nukleotider i det genetiske materiale af interesse. Desuden kan sekventeringen af ​​RNA (ribonukleinsyre) også afsløres.

Denne teknik har været uundværlig for udviklingen af ​​biologiske videnskaber. Det gælder også for andre områder af viden - som f.eks. Medicinsk diagnose og retsmedicinsk undersøgelse.

Tidligere blev sekventeringen af ​​en streng af DNA betragtet som en langsom og dyr aktivitet, hvilket tillod identifikation af kun nogle få basepar i oligonukleotiderne.

I dag er DNA-sekventering med alle videnskabelige fremskridt en rutinemæssig operation i mange laboratorier verden over takket være bidraget fra næsten 50 års forskning på dette område. Med hensyn til længden af ​​kæden kan du sekvens op til millioner af basepar på meget kort tid.

For at gøre det er der dusinvis af udviklede teknikker, der varierer i pris og nøjagtighed. I denne artikel beskriver vi både klassiske og moderne teknikker, hver med sine fordele og ulemper.

Hidtil tillader sekventeringsteknikkerne at opnå sekvensen af ​​komplette genomer, fra små prokaryoter og gær til det humane genom.

indeks

  • 1 struktur af DNA
  • 2 historie
  • 3 Sanger metode
    • 3.1 Hovedkomponenter af reaktionen
    • 3.2 Læsning af resultaterne
  • 4 Automatisk sekventering
  • 5 Maxam-Gilbert-sekventering
    • 5.1 Procedure
    • 5.2 Læsning af resultaterne
  • 6 Massiv sekventering
    • 6.1 Pyrosequencing
    • 6.2 Sekvensering ved syntese
    • 6.3 Sekventering ved ligering
    • 6.4 Sequencing Ion Torrent
  • 7 Eksempler
    • 7.1 Sekventeringen af ​​det humane genom
  • 8 Betydning og anvendelser
  • 9 Referencer

Struktur af DNA

For at forstå de metoder og teknikker, der anvendes til DNA-sekventering, er det nødvendigt at kende visse nøgleaspekter af molekylets struktur og sammensætning.

DNA er et biomolekyle, der findes i alle levende ting, fra bakterier til store vanddyr. Organeller - som mitokondrier og chloroplaster - har et cirkulært DNA-molekyle inde i dem. Selv i nogle vira er det genetiske materiale fundet DNA.

Strukturelt er DNA et sæt nukleotider. Hver enkelt er integreret med et kulhydrat, en nitrogenholdig base (A, T, C eller G) og en phosphatgruppe. Målet med DNA-sekventering er at afsløre rækkefølgen, hvori de fire nitrogenholdige baser findes i sekvensen.

historie

I midten af ​​1950'erne beskrev forskere Watson og Crick strukturen af ​​DNA ved hjælp af kristologiske teknikker. Ingen af ​​disse forskere havde imidlertid kunnet finde en måde at afdække sekvensen på.

Selv om der var nogle forgængere, den vigtigste begivenhed var oprettelsen af ​​Sanger-metoden, i 1977. Frederick Sanger, far til den metode, var en britisk biokemiker, vinder af to Nobelpriser for deres enorme bidrag til de biologiske videnskaber.

Denne teknik er også kendt i litteraturen som "kædeafslutning" eller dideoxynukleotider. Dernæst vil vi beskrive principperne for denne teknik og de der blev udviklet baseret på forbedring og innovation af dette.

Sangers metode

Udviklingen af ​​Sanger's metode repræsenterede en afgørende begivenhed inden for molekylærbiologi. Det involverer de grundlæggende komponenter i DNA replikationsprocessen, der normalt forekommer i cellen, men ved at tilføje en særlig komponent: dideoxynucleotider.

Hovedkomponenter af reaktionen

- DNA-polymerase: enzym-DNA-polymerasen er et afgørende element i processen. Dette molekyle er involveret i replikationen af ​​DNA-strengen, og dens rolle er syntesen af ​​den nye kæde, der matcher med komplementære deoxyribonukleotidtriphosphater.

Minde om, at DNA-thymin (T) at passe sammen med adeniner (A) til to hydrogenbindinger, mens cytosin (C) gør med guanin (G) med tre broer.

- Nukleotider Sanger-sekventering involverer to typer nukleotider, 2'-deoxynukleotider fire (forkortet dATP, dGTP, dTTP og dCTP) og de fire dideoxynucleotider (ddATP, ddGTP, ddCTP og ddTTP) Særlige.

Selv om dideoxynucleotider ligner de monomerer, der normalt indarbejdes i DNA, mangler de en -OH gruppe i deres struktur. Dette gør det umuligt at tilføje et nyt nukleotid til kæden.

Når et særligt nukleotid tilsættes - helt tilfældigt - til kæden i dannelse, er syntesen derfor lammet. På denne måde er der ved afslutningen af ​​reaktionen kæder af forskellig størrelse, hver hvor reaktionen blev standset på et andet punkt.

Eksperimentelt udarbejdes fire forsøg. Hver indeholder DNA'et ekstraheret fra den biologiske prøve af interesse, de normale nukleotider og en af ​​de fire typer af særlige nukleotider. Eller de specielle nukleotider er markeret med en slags fluorescerende markør (se nedenfor automatiseret sekventering).

Aflæsning af resultaterne

Det første trin er at adskille hver af de syntetiserede kæder i henhold til deres størrelse. Nogle vil være længere end andre, afhængigt af hvor de særlige baser blev indarbejdet.

Der er forskellige biokemiske teknikker, der tillader adskillelse af komponenterne i en blanding ved hjælp af størrelsen som en diskriminerende egenskab. I Sanger-metoden adskilles de forskellige kæder ved elektroforese. I de mest sofistikerede varianter af teknikken anvendes kapillærelektroforese.

Således bevæger de længere tråde mindre end de kortere varianter. Derefter går dette system gennem en læser, som genkender markøren indbefattet i hvert dideoxynukleotid. På denne måde kan rækkefølgen af ​​sekvensen være kendt.

Denne "første generation" teknik er i stand til at læse DNA-fragmenter ikke større end 1 kilobase. I øjeblikket anvendes Sanger metode i flere laboratorier, generelt i sine moderne varianter. Derudover bruges det til at bekræfte de opnåede resultater med de mest komplekse teknikker - men mindre præcise.

Automatisk sekventering

Når storskala sekventering er nødvendig, accelereres processen ved automatisering. Dette er en variant af Sanger kæde termineringsmetode, hvor primrene er markeret med fluorescerende produkter for at skelne dem.

Derefter køres reaktionsproduktet i en elektroforese - alt sammen i en enkelt bane. Når hvert fragment forlader den endelige del af gelen, identificeres den hurtigt ved sin fluorescerende label med en fejl, der omgiver 1%.

De mest sofistikerede systemer har et system med op til 96 kapillarrør, der drives af en computer koblet til en robot. Det vil sige, 96 DNA-prøver kan evalueres samtidigt. Processen der involverer elektroforese og analysen af ​​resultaterne er således fuldstændigt automatiseret.

På en dag kan disse systemer sekvensere op til 550.000 baser. Under processen er det menneskeligt arbejde unødvendigt, det tager kun ca. 15 minutter at starte metoden.

Sekventering af Maxam-Gilbert

Samtidig med at Sanger udgav sit arbejde, lykkedes to forskere ved navn Allan Maxan og Walter Gilbert at udvikle en anden metode til opnåelse af DNA-sekvensen. Metoden blev populær på det tidspunkt, men blev senere fordrevet af forbedringen af ​​Sanger's metode.

I modsætning til Sanger's metode involverer sekventeringen af ​​Maxan og Gilbert (eller kemisk sekventering, som det også er kendt) ikke hybridiseringsreaktioner. Metoden består af mærkning med reaktive midler i den ene ende efterfulgt af en renseproces.

Et af de negative aspekter ved denne teknik ligger i dens enorme kompleksitet og i brugen af ​​kemikalier, der er farlige for brugeren. Kemiske nedbrydning induceres ved anvendelse af DMS, myresyre, hydrazin og hydrazin med salte.

proces

Protokollen starter med mærkning ved 5'-enden af ​​strengen med phosphormarkøren 32, så sker en kemisk modifikation af den nitrogenholdige base, og den adskilles. Endelig opstår splittelsen af ​​den abasiske region.

Først forkortes kæden, der skal sekventeres, til mindre segmenter. Dette trin udføres med restriktionsenzymer, hvilket resulterer i enestående ekstremer.

Dernæst udføres reaktionen med en alkalisk phosphatase, hvis formål er at eliminere phosphatgruppen. Således kan en polynukleotidkinase anvendes til at udføre mærkning.

Kæden er denatureret (de to tråde åbner). Så fortsætter vi med at anvende kemikalierne. Disse spaltningsreaktioner udføres på en kontrolleret måde, og hvilke typer bindinger brydes af hvert anvendt kemikalie.

Aflæsning af resultaterne

Som i Sanger-metoden involverer aflæsningen af ​​resultaterne adskillelse efter størrelse af kæderne opnået i et elektroforesystem. Systemerne sammensat af polyacrylamid tillader at opnå en meget passende opløsning til læsning af gelen.

Massiv sekventering

Massiv sekventering omfatter en række nye metoder, forkortet som NGS, fra engelsk "Næste Generations Sequencing ".

De metoder, der er katalogiseret som NGS, kræver et tidligere trin af DNA-amplifikation (de virker ikke sammen med et enkelt molekyle). Derudover varierer de anvendte platforme meget. Principperne for de mest populære metoder vil blive beskrevet nedenfor:

pyrosekventering

Det involverer overvågning af frigivelsen af ​​et pyrophosphat, som forekommer hver gang et nyt nucleotid sættes til DNA-strengen. Et enzymsystem er koblet, således at lysemission (som kan detekteres af et kamera) forekommer hver gang et nyt nucleotid er inkorporeret.

Processen begynder med den separate inkubering af hver nitrogenholdig base for at verificere, om der er lysemissioner eller ikke. Pyrosequencing kan udføre læsning af lange tråde, men den konstaterede fejlrate er høj.

Sekvensering ved syntese

Dette indebærer inkorporering af mærkede nukleotider. Disse fluorescerende komponenter tilsættes, vaskes, og det inkorporerede nukleotid bemærkes. Derefter elimineres nukleotidmærkning, og syntesen af ​​strengen kan fortsætte. I det næste trin vil et mærket nukleotid også inkorporeres, og de nævnte trin vil blive gentaget.

En ulempe ved denne teknik opstår, når fluorescerende markører ikke fjernes fuldstændigt. Disse emissioner skaber baggrundsfejl, hvilket resulterer i betydelige fejl.

Sekventering ved ligering

Denne teknik varierer fra de andre, da den ikke bruger DNA-polymerase. I stedet er nøgle enzymet til denne metode ligase. Her anvendes DNA-fragmenter, der er fluorescensmærkede, er bundet af enzymet og detekteres.

Det største problem med denne teknik er den meget korte længde af fragmentet, der er i stand til at behandle.

Ion Sequencing Torrent

Denne teknik er baseret på måling af H ion+ som frigives hver gang et nyt nukleotid er inkorporeret. Princippet svarer meget til pyrosequencing, men meget billigere.

eksempler

Sekventeringen af ​​det humane genom

Sekventering af menneskets genom har været en af ​​de mest lovende udfordringer inden for biologi, samt at være en af ​​de mest anerkendte rivalier i videnskabens historie. Faktisk for de forskere, der er involveret i projektet, blev sekventering genomet en konkurrence.

I 1990 startede han det, der blev kaldt "menneskeligt genomprojekt", ledet af den berømte videnskabsmand, vinder af Nobelprisen, James Watson. Efter et år i 1991 tager Venter udfordringen med at "slå" Watson og sekventere genomet før ham. Men i 1992 gik Watson i pension og kommandoen blev taget af en anden forsker.

I 1995 annoncerede Venter sin succes i den fuldstændige sekventering af et bakteriel genom ved den tilfældige sekventeringsmetode. Tilsvarende meddelte det modsatte hold et år senere sekvenseringen af ​​gærgenomet.

I år 2000 blev løbet afsluttet. Begge virksomheder offentliggjorde deres foreløbige resultater af det komplette genom i to af de mest prestigefyldte tidsskrifter i videnskaben: natur og Videnskab.

Forskerne fortsatte dog med at forbedre forslagene, og i 2006 blev sekvenserne færdige med visse humane kromosomer.

Betydning og anvendelser

At kende nukleotidernes rækkefølge for et molekyle, der er lige så vigtigt som DNA, er værdifuldt for biologer og beslægtede fagfolk. Denne kæde af polynukleotider indeholder al den information, der er nødvendig for udvikling og vedligeholdelse af alle livsformer.

Af disse grunde er kendskab til denne sekvens væsentlig for biologisk forskning. Grundlæggende giver sekventering os mulighed for at måle en af ​​de vigtigste egenskaber ved biologiske systemer og at skabe forskelle mellem dem.

Sekventering anvendes i vid udstrækning af taxonomer og systematikere, da visse DNA-sekvenser tillader etablering af kriterier for at konkludere, om to organismer tilhører samme species eller ej, samt at kunne foreslå hypoteser om de fylogenetiske forhold mellem dem..

Derudover har DNA-sekventering applikationer inden for medicin og diagnostik. For eksempel er der overkommelige og tilgængelige systemer, der ved hjælp af sekventering tillader os at evaluere tendensen til at udvikle visse sygdomme (såsom kræft) ved hjælp af de såkaldte simple nukleotidpolymorfier (SNP)..

Undersøgelserne af den kriminalistiske og retsmedicinske type er også blevet beriget med teknikker til sekventering og kan bruges som pålidelige bevis for deltagelse af en bestemt person i en forbrydelse.

referencer

  1. Heather, J. M., & Chain, B. (2016). Sekvensen af ​​sekvenser: historien af ​​sekventerings-DNA. Genomics, 107(1), 1-8.
  2. Koboldt, D.C., Steinberg, K.M., Larson, D.E., Wilson, R.K., & Mardis, E.R. (2013). Den næste generation af sekventeringsrevolution og dens indvirkning på genomik. Cell, 155(1), 27-38.
  3. Levy, J. (2010). Videnskabelig rivalisering. Fra Galileo til det menneskelige genomprojekt. Paraninfo Editorial.
  4. Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, A.R. (1977). DNA-sekventering med kæde-terminerende inhibitorer. Forsøg på det nationale akademi for videnskab, 74(12), 5463-5467.
  5. Schuster, S.C. (2007). Næste generations sekventering omdanner dagens biologi. Naturmetoder, 5(1), 16.
  6. Xu, J. (Ed.). (2014). Næste generations sekventering. Caister Academic Press.