Voges-Proskauer test fundament, forberedelse og anvendelser



den Voges-Proskauer test er en biokemisk test, der bruges til at identificere bakterier, der tilhører familien Enterobacteriaceae. Især er det nyttigt at differentiere stammer af Escherichia coli af Klebsiella og Enterobacter, blandt andre.

Prøven udføres i det flydende dyrkningsmedium kaldet methyl red-Voges Proskauer, bedre kendt af akronym RM / VP. Dette medium er sammensat af bufferet polypepton, glucose, dipaliumphosphat og destilleret vand.

Det nuværende RM / VP-medium er en modifikation af Clark og Lubs-mediumet, som oprindeligt indeholdt en lavere koncentration af peptoner og glucose. Derfor blev der produceret mindre hydrogenion, der kræves til den positive Voges-Proskauer-reaktion.

Prøven er baseret på mikroorganismens evne til at anvende glucose via butylenglycolruten og danner et neutralt endeprodukt kaldet acetoin i nærvær af oxygen og en alkalisk pH.

I RM / VP-mediet kan man, udover at kunne afsløre Voges-Proskauer-testen, også afsløre den methylrøde test.

indeks

  • 1 Foundation
    • 1.1 Grundlaget for Voges-Proskauer-testen
    • 1.2 Grundlag for udvikling af test og fortolkning
  • 2 Fremstilling
    • 2,1 medium RM / VP
    • 2.2 Voges A Reagent
    • 2.3 Voges B Reagens
  • 3 Procedure for Voges-Proskauer-testen
    • 3.1 Udvikling af testen
  • 4 Brug
  • 5 Kvalitetskontrol
  • 6 referencer

fundament

Grundlaget for Voges-Proskauer-testen

De pluripeptoner, der er til stede i mediet, giver næringsbehovene afgørende for bakteriel vækst. For sin del er glucose den vigtigste forbindelse. Mange bakterier har evnen til at metabolisere glucose og danne pyruvsyre.

Pyruvinsyren er et middelpunkt i glucosemetabolismen, og derfra kan hver mikroorganisme tage forskellige veje. Nogle vil danne blandede syrer, såsom mælkesyre, eddikesyre, myresyre og ravsyre, og andre vil danne neutrale produkter såsom 2,3-butandiol.

Voges-Proskauer-testen afslører mikroorganismens evne til at danne acetylmethylcarbinol (acetoin), et mellemprodukt af 2,3-butandiol under aerobiske betingelser.

Acetoin reduceres og danner 2,3-butandiol, men denne reaktion er reversibel, så hvis 2,3-butandiol oxideres, dannes acetoin. Derfor er ilt afgørende.

Dipaliumphosphat er den buffer, der dæmper blandingen ved en pH på 6,9 ± 0,2..

Grundlag for udvikling af test og fortolkning

For at demonstrere reaktionen skal der udføres en udvikling ved anvendelse af to reagenser (Barrit reagenser), kendt som Voges A og Voges B.

Voges A er en 5% opløsning af a-naphthol, og Voges B er et 40% kaliumhydroxidpræparat. Hvis kaliumhydroxid ikke er tilgængelig, kan det erstattes med 40% natriumhydroxid.

Δ-naphthol er en katalysator, der vil øge intensiteten af ​​reaktionens farve, hvilket gør testen mere følsom. A-naphtholet skal altid tilsættes først, omrøring af røret, så mediet kommer i kontakt med ilt. På denne måde oxideres acetoinet til diacetyl, og 2,3-butandiol oxideres til dannelse af acetoin, der overføres til diacetyl.

Sådan binder α-naphthol til diacetyl, som igen er forbundet med guanidinkernen til stede i aminosyren arginin, sidstnævnte kommer fra pluripeptonerne.

For sin del er kalium eller natriumhydroxid ansvarlig for at absorbere CO2 og reagere med peptonerne. Denne reaktion medfører dannelsen af ​​en pink-laksfarve, der er tydelig synlig efter rystning af røret meget godt.

For at farvningen skal ske øjeblikkeligt, skal korrekte mængder diacetyl, pepton og a-naphthol blandes. Hvis dette ikke sker, lad røret hvile i 15 minutter før tolkning.

Normalt er testen positiv efter 2 til 5 minutter, når en svag lyserød farve kan observeres. Hvis du står i ro i 30 minutter til 1 time, vil intensiteten af ​​farven være maksimal (dyb rød).

En negativ test vil være tydelig, når bouillon er gul. Efter 1 time, hvis testen er negativ, kan en kobberfarve dannes som et resultat af reaktionen af ​​kaliumhydroxid på a-naphthol.

forberedelse

Mellem RM / VP

Afvej 17 g af det dehydrerede dyrkningsmedium og opløs i 1 liter destilleret vand. Lad stå i 5 minutter. Opvarm til kogning for at opløse helt. Serveres 3 til 4 ml i rør og steriliser i autoklav ved 121 ° C i 15 minutter.

Det dehydrerede dyrkningsmedium er beige, og det fremstillede medium er lysegult.

Den endelige pH i mediet er 6,9 ± 0,2.

Voges A Reagent

Afvej 5 g a-naphthol og opløs i 50 ml ethylalkohol (absolut). Fortsæt derefter tilsættes ethylalkohol til op til 100 ml.

Reagens Voges B

Afvej 40 g kaliumhydroxid og opløs i 50 ml destilleret vand i et bægerglas. Glaset skal anbringes i et koldt vandbad for at styre temperaturen, da opløsningen på opløsningstiden stiger kraftigt.

Efter at opløsningen er kold, overføres den til en gradueret ballon og bringes op til 100 ml med destilleret vand.

Procedure for Voges-Proskauer-testen

For at udføre Voges-Proskauer-testen inokuleres en RM / VP bouillon med den undersøgte mikroorganisme fra en ren kultur på 18 til 24 timer.

Inokulumet bør ikke være for tæt. Det inkuberes ved 35-37 ° C i 24 til 48 timer, selv om det til tider er inkubation nødvendigt i flere dage. Cowan og Steel mener, at 5 dage er den minimale inkubationstid, der er nødvendig for at detektere alle positive Voges-Proskauer (VP) arter af familien Enterobacteriaceae.

Udvikling af testen

Separér en 1 ml alikvot i et rør og udfør udviklingen som følger: Placer 12 dråber (0,6 ml) Voges A reagens og 4 dråber (0,2 ml) Voges B. Bland til luftning og lad stå i 5 - 10 minutter før udførelse. Men hvis testen stadig er negativ, lad den stå og observere røret efter 30 minutter til 1 time.

Udseendet af en lyserød-rød farve indikerer, at Voges-Proskauer-reaktionen er positiv. Hvis mediet bliver gul, er reaktionen negativ.

Tilføjelsen af ​​udviklerne i den angivne rækkefølge og mængde er afgørende for at undgå falske negativer.

brug

Voges-Proskauer-testen er nyttig til at skelne mellem stammer af E. coli som er VP-negative, blandt slægterne Klebsiella, Enterobacter, Serratia, blandt andre, som er VP-positive.

Kvalitetskontrol

Kontrolstammer kan bruges til at teste kvaliteten af ​​det forberedte medium. Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 43071, Salmonella typhimurium og Enterobacter cloacae ATCC 13047.

De forventede resultater er positive Voges-Proskauer-reaktioner kun for K. pneumoniae og E. cloacae. Resten giver negative reaktioner.

referencer

  1. Laboratorier Britania. MR-VP Medium. 2015. Tilgængelig på: www.britanialab.com
  2. Microkit Laboratories M-Ident Voges Proskauer. 2014. Tilgængelig: http://www.medioscultivo.com
  3. Mac Faddin J. (2003). Biokemiske test til identifikation af bakterier af klinisk betydning. 3. ed. Editorial Panamericana. Buenos Aires Argentina.
  4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Mikrobiologisk diagnose af Bailey & Scott. 12 udg. Editorial Panamericana S.A. Argentina.
  5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnose. 5. udgave. Editorial Panamericana S.A. Argentina.