Agar har standard fundament, forberedelse og anvendelser

den standard konto agar er et solidt, ikke-selektivt dyrkningsmedium, der er beregnet til kvantificering af den aerobiske mikrobielle belastning til stede i prøver af drikkevand, spildevand, mælkedrikke, blandt andre fødevarer. Dette medium er også kendt som PCA-agar, for dets akronym i engelsk Plate Count Agar. Det blev oprettet i 1953 af Buchbinder, Baris og Goldstein.

Standard agar medium kontoen er sammensat af gær ekstrakt, triptein, glucose, agar og destilleret vand. Denne formulering indeholder basale ernæringsmæssige elementer, der tillader udviklingen af ​​den nuværende aerobiske mikrobielle belastning, ikke krævende.

Da mediet ikke indeholder inhibitorer, kan bakterierne udvikle sig uden nogen begrænsninger, så det er ideelt til den generelle koloniantal. Pladekvantificeringsteknikken vil imidlertid ikke registrere alle de tilstede bakterier, men kun de, som er i stand til at vokse under de miljømæssige forhold, som standardsåget agar udsættes for..

På denne måde søger pladekvantificeringsteknikken generelt at bestemme mængden af ​​aerobe mesofile typer bakterier, det vil sige dem der udvikler ved temperaturer mellem 25 og 40 ° C med en optimal væksttemperatur ved 37 ° C.

Denne bakteriegruppe er meget vigtig, fordi der er de fleste af de patogene bakterier til mennesker.

Det skal bemærkes, at det undertiden kan være interessant at kvantificere mængden af ​​psykofile bakterier til stede i fødevarer. Disse bakterier er dem der udvikler sig ved lave temperaturer (< 20°C) y son las responsables de que los alimentos se descompongan más rápido, aun estando en nevera.

På samme måde kan termofile bakterier, som udvikler sig i området mellem 50 ° C og 80 ° C eller mere, være vigtige i visse typer fødevarer, såsom dåse.

Mikrobiel kvantificering udtrykkes i kolonidannende enheder (CFU) pr. Gram eller milliliter prøve.

indeks

• 1 Foundation
• 2 Fremstilling
  • 2.1 Til pladehældningsteknikken
  • 2.2 Til overfladeplantning
• 3 Brug
  • 3.1 Pladhældningsteknik (podet med dybde)
  • 3.2 Teknik sået på overfladen
• 4 Kvalitetskontrol
• 5 begrænsninger
• 6 referencer

fundament

Standardtællingsmediet er designet til at muliggøre en tilfredsstillende udvikling af ikke-krævende aerobiske bakterier, da gærkstrakt, triphein og glucose giver de nødvendige næringsstoffer til god mikrobiel udvikling.

På den anden side har mediet en klar farve og et gennemsigtigt udseende, og derfor er det ideelt til at vise kolonier udviklet ved dybsåning (hældning i en plade).

Det er også muligt at tælle kolonier ved metoden til såning på overfladen med en spatel af Drigalski.

Når den mikrobielle belastning er høj, skal desimale fortyndinger af prøven under undersøgelse foretages for at tælle CFU'erne.

Det skal bemærkes, at dette medium anbefales af American Public Health Association (APHA) til optælling af aerobiske mesofiler.

forberedelse

Væg 23,5 g af det dehydrerede medium og opløs i 1 liter destilleret vand. For fuldstændig opløsning skal blandingen opvarmes omrøres ofte, indtil den koger. De efterfølgende trin afhænger af den såningsteknik, der skal anvendes.

Til pladehældningsteknikken

Fordel ved at dispensere 12 til 15 ml i reagensglas. Derefter steriliseres i en autoklav ved 121 ° C i 15 minutter. Tillad at størkne lodret i form af en blok. Opbevares i køleskab indtil brug.

Smelt køen, når den skal bruges. Efter smeltning opbevares det i et vandbad ved 44-47 ° C, mens der fremstilles prøver.

Til plantning på overfladen

Steriliser mediet i en autoklav ved 121 ° C og fordel derefter 20 ml i sterile petriskåle. Tillad at størkne, invertere og opbevare i køleskab indtil brug.

Temper pladerne før brug. Mediumets pH bør være 7,0 ± 0,2.

brug

Agarstandardtællingen anvendes i den aerobiske mesofil-tælleteknik under den mikrobiologiske analyse af vand og mad. Tællingen af ​​aerobiske mesofiler er nødvendig, da det bestemmer den sundhedsmæssige kvalitet af prøven under undersøgelse.

Anvendelsen af ​​denne teknik (ved anvendelse af dette medium) tillader makroskopisk visualisering af isolerede kolonier til deres kvantificering.

Plaque pouring teknik (podet med dybde)

-proces

Teknikken består af følgende:

1) Homogeniser prøven for at omfordele de tilstede bakterier.

2) En initial suspension udføres i et sterilt hætteglas eller en pose med respekt for forholdet 10 g eller 10 ml prøve i 90 ml fortyndingsmiddel (10^-1).

3) Fra den oprindelige suspension foretages de relevante decimalfortyndinger afhængigt af typen af ​​prøve. Eks: (10^-2, 10^-3, 10^-4). Fortyndingerne er fremstillet med peptonvand eller phosphatbuffer.

For at gøre dette skal du tage 1 ml af den oprindelige suspension og placere i 9 ml fortyndingsmiddel, fortsæt fortyndingerne om nødvendigt og tag nu 1 ml fortynding.^-2 og så videre.

4) Tag 1 ml af hver fortynding og anbring den i tomme sterile petriskåle.

5) Til hver plade føjes 12 til 15 ml standardtalagar, der tidligere er smeltet og sat til 44-47 ° C.

6) Giv glatte rotationsbevægelser til pladerne for at fordele prøven til agar ensartet og tillade størkning.

7) Omvendte plader og inkuber ved 37 ° C i aerobiose i 24 til 48 timer.

8) Når tiden er færdig, fortsæt med at undersøge pladerne og tælle kolonierne i fortyndingen, der tillader det. Det er valgt til at tælle de plader, der har mellem 30 og 300 CFU.

Tællingen kan udføres manuelt, eller kolonitælleren kan bruges.

De tilladte værdier pr. Ml prøve kan variere fra land til land i overensstemmelse med de standarder, som de styres til.

-Beregning af UFC

Den generelle beregning foretages ved anvendelse af følgende formel:

Udtryk resultaterne i 1 eller 2 cifre, multiplicere med passende base 10. Eksempel: Hvis resultatet er 16.545, afrundes det baseret på det tredje ciffer til 17.000 og vil blive udtrykt som følger: 1,7 x 10⁴. Nu, hvis resultatet var 16.436 er afrundet til 16.000 og udtrykkes 1,6 x 10⁴.

Teknik plantet på overfladen

-proces

-Inokuleres med 0,1 ml af den direkte prøve, hvis den er flydende, initial suspension 10^-1 eller konsekutive fortyndinger 10^-2, 10^-3 osv., midt i en standardkonto-agarplade.

-Fordel prøven jævnt med Drigalski spatel eller L-formet glasstang. Lad stå i 10 minutter.

-Omvendte plader og inkuberes i aerobiosis ved 37 ° C i 24 til 48 timer.

-Fortsæt med at tælle kolonierne, vælg de plader, der ligger i intervallet mellem 20 - 250 CFU.

-Beregning af UFC

Til beregningen anvendes fortyndingsfaktoren, hvilket er den inverse. Nummeret er afrundet til 2 signifikante cifre (afrunding i henhold til det tredje ciffer) og udtrykkes i base 10-effekt. Hvis f.eks. 224 CFU tælles i prøven uden fortynding (10^-1), 22 x 10 er rapporteret¹  UFC, men hvis tallet var 225 rapporteres det 23 x 10¹ UFC.

Nu, hvis du tæller 199 CFU i fortynding 10^-3, 20 x 10 vil blive rapporteret⁴ UFC, men hvis 153 CFU tælles i samme fortynding, vil 15 x 10 blive rapporteret⁴ UFC.

Kvalitetskontrol

Standardtællingskulturmediet kan evalueres ved anvendelse af kendte certificerede stammer, såsom: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri ATCC 12022.

Hvis dyrkningsmediet er i optimale forhold, forventes tilfredsstillende vækst i alle tilfælde bortset fra L. fermentum der kan have en regelmæssig præstation.

For at vurdere steriliteten af ​​dyrkningsmediet bør en eller to plader af hver fremstillet batch (ikke-inokuleret) inkuberes ved 37 ° C i aerobioser i 24 timer. I slutningen af ​​denne tid bør der ikke observeres nogen vækst eller farveændring af mediet..

begrænsninger

-Smør ikke agar mere end én gang.

-Det forberedte medium kan vare op til 3 måneder, så længe det opbevares i køleskab og beskyttes mod lys.

-Dette medium er ikke egnet til krævende mikroorganismer eller anaerober.

referencer

1. National Administration of Medicines Food and Medical Technology (ANMAT). Mikrobiologisk analyse af fødevarer, officiel analytisk metode, indikator mikroorganismer. 2014 bind 3. Tilgængelig på: anmat.gov.ar
2. Difco Francisco Soria Melguizo Laboratories, S.A. Plate Count Agar. 2009. Tilgængelig på: http://f-soria.es
3. Laboratorier Conda Pronadisa. Agar for standardmetoder (PCA) ifølge APHA og ISO 4833. Tilgængelig på: condalab.com
4. Laboratorier Britania. Tæller på agarplade. 2015. Tilgængelig på: britanialab.com
5. Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B og Velázquez O. 2009. Teknikker til mikrobiologisk analyse af fødevarer. 2. udgave Fakultet for Kemi, UNAM. Mexico. Tilgængelig på: depa.fquim.unam