Agar Müeller Hinton fundament, forberedelse og brug

den Müeller Hinton agar Det er et solidt, ikke-selektivt næringsmedium, der består af kødinfusion, kaseinsyrepepton, stivelse, agar og destilleret vand. Dette medium tillader en fremragende mikrobiel udvikling af de hurtigst voksende bakterier.

Det blev oprindeligt oprettet af John Howard Müeller og Jane Hinton for at isolere ernæringsmæssige krævende bakterier, som f.eks Neisseria gonorrhoeae og Neisseria meningitidis. På grund af dets egenskaber viste det sig imidlertid at være ideelt til undersøgelse af modtagelsen af ​​antibiotika, hvilket giver pålidelige og reproducerbare resultater.

Derfor Mueller Hinton agar er dyrkningsmediet accepteret af Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) og European Committee on Test for antimikrobiel følsomhed for udførelsen af ​​antimikrobiel resistensbestemmelse ved diffusion metode disk Kirby og Bauer.

indeks

• 1 Foundation
• 2 Fremstilling
• 3 anvendelser
  • 3.1 Antimikrobiell teknik
  • 3.2 Strategisk placering af diske på Müeller Hinton agar
• 4 Årsager til fejlagtige resultater
• 5 begrænsning
• 6 Kvalitetskontrol
• 7 referencer

fundament

Fordi det er et ikke-selektivt næringsmiddel, er det fremragende til væksten af ​​de fleste patogene bakterier.

På den anden side gør dens enkle sammensætning stofferne let diffusere på den, hvilket er et væsentligt kendetegn ved følsomhedstesten ved diskdiffusionsmetoden..

Et andet af dets egenskaber er, at det indeholder en lav mængde hæmmere, som gør det muligt effektivt at evaluere sulfonamider, trimethoprim og tetracycliner..

Det skal dog tages i betragtning, at mediet skal opfylde visse betingelser for at sikre, at det fungerer korrekt, herunder:

PH-justering, agardybde og tilstrækkelig koncentration af thymin, thymidin, Ca⁺⁺, mg⁺⁺ og Zn⁺⁺.

Vi skal også vide, at metoden er standardiseret, og derfor skal alle parametre opfyldes, såsom:

Inokulumkoncentration, koncentration og konservering af antibiotiske skiver, placere passende antal skiver på agar, afstanden mellem en disk og andre strategiske placering af visse antibiotika, atmosfæren, temperatur og tid inkubation.

forberedelse

Vejer 37 g af det dehydrerede Müeller Hinton-medium og opløses i 1 liter destilleret vand. Varm mediet under omrøring for at hjælpe med at opløse det. Lad koge i 1 minut.

Tag autoklaven til at sterilisere ved 121 ° C i 15 minutter. Ved fjernelse fra autoklaven skal fiola'en anbringes i et vandbad ved 50 ° C for at afkøle. Hæld 25-30 ml i sterile petriskåle med en diameter på 10 cm.

Pladerne skal have en gennemsnitlig tykkelse på 4 mm (ideel) med et interval på 3-5 mm tilladt.

Hvis det er ønsket at fremstille blodagar ved anvendelse af Müeller Hinton-agarbase, hældes 5% sterilt og defibrineret lammeblod, før det serveres på pladerne..

Den endelige pH af mediet bør være mellem 7,2 og 7,4.

Invester og opbevar i køleskab indtil brug. Lad pladen tage stuetemperatur inden brug.

Farven af ​​det fremstillede medium er lys beige.

applikationer

Det er vant til at udføre antibiogrammet eller antibiotikaresensibilitetstesten til de fleste ikke-hurtigt voksende patogener.

Hvis agar er suppleret med blod, tjener det til at udføre antibiotikumet af krævende mikroorganismer såsom: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp, Neisseria meningitidis, blandt andre. Det har også været vant til at isolere Legionella pneumophila.

Antibiogramteknik

Inden antibiogrammet udføres, skal der fremstilles en bakteriel opløsning svarende til 1,5 x 10⁸ celle.

At gøre dette, tager 3 til 4 kolonier fra ren kultur og suspenderes i en sojanæringsmedium trypticase eller Mueller Hinton bouillon, inkuberet i 2 til 6 timer, og koncentrationen blev indstillet med sterilt saltvand, sammenlignet med en standard McFarland af 0,5%.

Hvis de kræver mikroorganismer, kan kolonier suspenderes direkte indtil de når koncentrationen på 0,5% af Mac Farland. Herefter suges Müeller Hinton-plade med en vatpind imprægneret med den tilberedte bakterieopløsning.

For at gøre dette skal du dyppe swaben i opløsningen og derefter fjerne overskydende væske ved at trykke mod rørets vægge. Umiddelbart efter at vatpinden er passeret over hele overfladen, efterlader ingen uberørte steder, så drej pladen lidt og gensås. Operationen gentages 2 gange.

Lad stå i 10 minutter, og læg derefter antibiotikumpladerne med en steril pincet, hvilket giver et mellemrum på 24 mm mellem dem. Når du har anbragt hver disk på agaret, tryk let på hver med klemmen for at sikre, at de er godt klæbte.

Efter processen bliver pladen inverteret og inkuberet ved 35-37 ° C i aerobiose i 16 til 18 timer. Hvis det er en krævende mikroorganisme, kan det kræve mikroerofili, og hvis antibiotikumet indeholder oxacillinskiver, skal det læses efter 24 timer.

En lineal bruges til at måle diameteren af ​​hver halo. Resultaterne skal registreres i mm. Derefter korreleres de opnåede værdier med tabellerne med cut-punkter, der udgives af den nuværende CLSI manual.

Rapportér som følsom (S), mellemliggende (I) eller resistent (R), alt efter omstændighederne.

Antibiotika udvælges ifølge den isolerede mikroorganisme og typen af ​​infektion, der forekommer.

Nogle gange bør den strategiske placering af antibiotika anses for at vise fænotypiske modstandsmønstre.

Strategisk placering af diske på Müeller Hinton agar

For enterobakterier skal clavulansyrepladen placeres foran 3. og 4. generation cefalosporiner. En ægformet udvidelse indikerer, at stammen er en producent af beta-lactamaser med udvidet spektrum (ESBL). Dette betyder, at patienten ikke skal behandles med nogen cephalosporin.

I Staphylococcus er det vigtigt at placere erythromycin eller azithromycin disken foran clindamycin disken (D-test).

En resistent halo i erythromycin og en fladning i clindamycinhalogen indikerer, at stammen har en inducerbar resistens over for clindamycin, stamme (RIC). Det betyder, at en behandling med clindamycin ikke vil være effektiv.

Søgning efter AMP C inducerbare stammer i Enterobacteriaceae og nogle ikke-fermenterende gramnegative baciller, skiver ceftazidim, cefoxitin eller piperacillin tazobactam versus imipenem disc ansigt i en afstand på 27 mm.

En halo udfladet i en af ​​diskene mod imipenem indikerer tilstedeværelsen af ​​inducerbar AMP C.

Til søgning efter konstitutiv AMP C står en cloxacillin 500 μg disk over for ceftazidim (30 μg) og med cefotaxim (30 μg) i en afstand på 25 mm. En udvidet halo i et af cefalosporinerne indikerer positivitet.

Cloxacillin disken kan også erstattes af en 9 mm disk af Whatman No. 6 filterpapir imprægneret med phenylboronsyre (400 μg) med en afstand på 18 mm. Det fortolkes som det foregående.

Endelig at undersøge produktionen af ​​metallo-beta-lactamaser, især i Pseudomonas aeruginosa, imprægneret skive anvendt med 10 ul ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA 750 g) og thioglycolsyre (SMA 300 mg), der vender mod diske og imipenem meropenem, i en afstand på 15 mm.

Testen er positiv, hvis der er udvidelse af imipenem- eller meropenemhalogenerne mod EDTA / SMA-disken. Dette resultat skal bekræftes af den modificerede Hodge test.

Denne metode består i at inokulere en stamme af Escherichia coli ATCC 25922 på Müeller Hinton-pladen. En imipenem-disk er placeret i midten af ​​pladen, og der dannes en fløjte fra disken mod periferien med belastningen af P. aeruginosa mistænkelige. Du kan teste op til 4 stammer pr. Plade.

Testen vil være positiv, hvis der er en forvrængningszone af imipenemhalogen omkring stria.

Årsager til fejlagtige resultater

-Disketter af dårligt bevarede antibiotika kan frembringe falske modstande. For eksempel er oxacillinskiven meget sårbar over for temperaturændringer.

-En pH-værdi af mediet under den angivne (syre) giver mindre haloer i aminoglykosider og makrolider (risiko for falsk modstand) og større haloer penicillin, tetracyclin og novobiocin (risiko for falsk følsomhed).

-Hvis pH-værdien er over den angivne (alkaliske) omdannes de ovenfor beskrevne virkninger.

-Medier med høje tymin- og thymidinkoncentrationer påvirker signifikant reduktion af inhalationshalogenerne af sulfonamider og trimetoprim.

-Høje koncentrationer af calcium og magnesium giver falsk modstand af aminoglycosider, polymyxin B og tetracycliner mod stammer af Pseudomonas aeruginosa.

-Lav koncentration af calcium og magnesium producerer falske følsomheder af aminoglycosider, polymyxin B og tetracycliner mod stammer af Pseudomonas aeruginosa.

-Tilstedeværelsen af ​​zink påvirker resultaterne af carbapenems skiverne (imipenem, meropenem og ertapenem).

-Tykkelsen af ​​mediet under 3 mm giver falske følsomhedsresultater, medens en tykkelse over 5 vil frembringe falsk modstand.

-Mobiliseringen af ​​diske i antibiogrammet vil give deformerede haloer, da antibiotikudladningen er øjeblikkelig.

- Meget svage inokulumer påvirker resultaterne, da der ikke vil være nogen ensartet eller sammenflydende vækst i agar, en nødvendig betingelse for at kunne måle inhiberingszoner, ud over det faktum, at haloerne kan give større end normalt.

-Overbelastet inokulat kan give haloer mindre end normalt.

-Hvis du ikke respekterer afstanden mellem diske, får du en halo til at overlappe en anden og kan ikke læses korrekt.

-Inkubere med CO₂ øger størrelsen af ​​halerne af tetracyclin og methicillin diske.

-Inkubation ved temperaturer under 35 ° C giver større haloer.

-Tilsætningen af ​​blod formindsker sulfonamidernes halo-størrelse.

begrænsning

Sensibiliteten af ​​et antibiotikum demonstreret i antibiogrammet mod en mikroorganisme (in vitro) er ikke en garanti for at det vil fungere in vivo.

Kvalitetskontrol

For at vide, om mediet indeholder den rigtige mængde thymin, skal en stamme såes af Enterococcus faecalis ATCC 29212 og test modtagelsen over for trimethoprim sulfamethoxazol (SXT), det skal give en halo lig med eller> 20 mm for at være tilfredsstillende.

referencer

1. "Agar Müller-Hinton." Wikipedia, Den frie encyklopædi. 16. november 2018, 12:23 UTC. Jan 27, 2019, 04:22
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Mikrobiologisk diagnose af Bailey & Scott. 12 udg. Editorial Panamericana S.A. Argentina.
3. Cona E. Betingelser for et godt følsomhedsundersøgelse ved agar diffusionstest. Rev Chil Infect, 2002; 19 (2): 77-81
4. Difco Francisco Soria Melguizo Laboratorium. Müeller Hinton agar med 5% fårblod. 2009. Tilgængelig på: http://f-soria.es
5. BD Müeller Hinton II Agar laboratorium. 2017. Tilgængelig på: .bd.com
6. Laboratorier Britania. Müeller Hinton agar. 2015. Tilgængelig på: britanialab.com
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnose. 5. udgave. Editorial Panamericana S.A. Argentina.
8. Martínez-Rojas D. Betalactamasas type AmpC: Generelt og metoder til fænotypisk detektion. Rev. Soc. Ven. Microbiol. 2009; 29 (2): 78-83. Tilgængelig på: scielo.org.
9. Perozo A, Castellano M, Ling E, Arraiz N. Fenotypisk påvisning af metallobetalactamaser i kliniske isolater af Pseudomonas aeruginosa. Kasmera, 2012; 40 (2): 113-121. Tilgængelig på: scielo.org.