Agar Sabouraud fundament, forberedelse og brug



den Sabouraud agar, Også kendt som Sabouraud dextrose agar er det et fast dyrkningsmedium, især beriget til isolering og udvikling af svampe, såsom gær, forme og dermatophytter..

Derfor kan dette middel ikke mangle i et mikrobiologisk laboratorium for at undersøge tilstedeværelsen af ​​patogene eller opportunistiske svampe, enten fra kliniske eller ikke-kliniske prøver. Ligeledes er den også ideel til vækst af filamentøse bakterier såsom Streptomyces og Nocardia. Dens anvendelse er meget bred, den kan bruges i menneskelig, dyr, plante og industriel mykologi.

Dette medium blev oprettet i 1896 af den berømte dermatolog Raimond Sabouraud, der blev en verdenskendt specialist i sygdomme i hovedbunden, hovedsageligt forårsaget af dermatofytter..

Dens oprettelse var så vigtig, at den er blevet brugt siden da, og det fortsætter i dag, selv om der med nogle ændringer.

Selvom især for svampe, i dette medium bakterie de kan vokse, således for prøver med blandet flora, herunder antibiotika er påkrævet i præparatet og dermed hæmme væksten af ​​bakterielle flora, der kan være til stede.

Valget af antibiotika bør foretages med omhu og under hensyntagen til den type svamp, som du vil genoprette, da nogle er hæmmet i nærvær af visse stoffer.

indeks

  • 1 Foundation
    • 1.1 Mest anvendte kombinationer af Sabouraud dextrose agar med antibiotika
  • 2 Fremstilling
    • 2,1 Dextrose Sabouraud Agar 
    • 2.2 Sabouraud Dextrose Agar (Modifikation af Emmons)
    • 2.3 Sabouraud dextrose agar (modifikation af Emmons) med chloramphenicol
    • 2,4 Dextrose Sabouraud Emmons agar med cycloheximid
    • 2,5 Dextrose Sabouraud Agar (Emmons) med chloramphenicol og cycloheximid
    • 2.6 Andre antibiotika, der kan tilsættes
  • 3 Specielle overvejelser
  • 4 Kvalitetskontrol
  • 5 anvendelser
    • 5.1 Primær dyrkning
    • 5.2 Sporulation
    • 5.3 Bevarelse
    • 5.4 Mikrokulturer
    • 5.5 I human mykologi
    • 5.6 Dyrmykologi
    • 5.7 Miljømykologi
    • 5.8 Industriel mykologi
    • 5.9 Plant mykologi
  • 6 referencer

fundament

Sabouraud-agarmedium er i sin oprindelige formulering er svagt selektiv, grundet dens syre pH 5,6 ± 0,2, og stadig bakterier kan vokse, især i langvarige inkubationer.

Mediet indeholder kaseinpepton og pankreas fordøjet animalsk væv, som tilvejebringer carbon- og nitrogenkilden til udvikling af mikroorganismer.

Det indeholder også en høj koncentration af glukose, som virker som en energikilde, der favoriserer svampens vækst over bakterier. Alle blandet med agar-agar, en komponent der giver den rette konsistens.

På den anden side kan Sabouraud dextrose agar være selektiv, hvis antibiotika tilsættes.

Med antibiotika er det særligt nyttigt i sårprøver, åbne sår eller nogen prøve, hvor stor bakteriel forurening mistænkes.

Mest anvendte kombinationer af Sabouraud dextrose agar med antibiotika

-Sabouraud agar med chloramphenicol: Ideel til genopretning af gær og filamentøse svampe.

-Sabouraud agar med gentamicin og chloramphenicol: på denne måde vokser de fleste filamentøse svampe og gær, og hæmmer en lang række bakterier, herunder Enterobacteriaceae, Pseudomonas og Staphylococcus.

-Sabouraud agar med cycloheximid: Det er især nyttigt for prøver fra huden eller luftveje, så længe mistanken er dimorfe svampe.

Cycloheximid bør anvendes med forsigtighed; Selv om det bruges til at hæmme væksten af ​​ikke-patogene eller miljømæssige svampe og gær, som kan være til stede som forurenende stoffer i en prøve, hæmmer det også væksten af ​​nogle svampe, såsom Cryptococcus neoformans,  Aspergillus fumigatus, Allescheria boydii, Penicillium sp og andre opportunistiske svampe.

-Sabouraud agar med chloramphenicol plus cycloheximid: bruges primært til at isolere dimorfe dermatofytter og svampe. Det har den ulempe, at det hæmmer nogle arter af opportunistiske svampe som Candida no albicans, Aspergillus, Zygomycetes eller C. neoformans.

-Sabouraud agar med chloramphenicol, streptomycin, penicillin G og cycloheximid: er ideel til ekstremt prøver forurenet med bakterier og saprofytiske svampe, men har den ulempe, hæmmer væksten af Actinomyces og Nocardias, ud over de ovennævnte opportunistiske svampe.

forberedelse

Hvis du har ingredienserne separat, kan du forberede den på følgende måde:

Dextrose agar Sabouraud 

beklagelse:

- 40 g dextrose

- 10 g pepton

- 15 g agar-agar

- Mål 1000 ml destilleret vand

Alle ingredienserne blandes, pH justeres til 5,6. Opløs opløsningerne op ved at koge, fordel 20 ml af mediet i rør på 25 x 150 mm uden flange og helst med bomuldstoppe.

Andre rørstørrelser kan også anvendes afhængigt af tilgængelighed.

De autoklaveres i 10 minutter ved en trykatmosfære (121 ° C). Overskrid ikke autoklaveringstiden. Når man forlader autoklaven, vippes rørene med en støtte, indtil de størkner i en fløjtestop..

En anden måde er at opløse ingredienserne ved opvarmning, indtil det koger. I den samme autoklave fiola i 10 minutter og fordel derefter 20 ml i petriskåle.

Hvis et Sabouraud dextrose agarmedium er tilgængeligt, som allerede indeholder alle ingredienserne, fortsætter vi med at veje den mængde, der er angivet af det kommercielle hus til en liter vand. Resten af ​​trinene er de samme som dem, der er beskrevet ovenfor.

Dextrose agar Sabouraud (modifikation af Emmons)

beklagelse:

-  20 g dextrose

- 10 g pepton

-  17 g agar-agar

-  Mål 1000 ml destilleret vand

Alle ingredienserne blandes, pH justeres til 6,9. Fortsæt på samme måde som i det foregående tilfælde.

Der er kommercielle huse, der tilbyder medium med alle ingredienserne. I dette tilfælde vejes og fremstilles som beskrevet i indsatsen.

Sabouraud dextrose agar (modifikation af Emmons) med chloramphenicol

Chloramphenicol stamopløsning

- Væg 500 mg chloramphenicol base

- Mål 100 ml 95% ethanol

- mix

Sabouraud dextrose agarmediet (Emmons) fremstilles som beskrevet ovenfor, og derudover tilsættes 10 ml chloramphenicol stamopløsning for hver liter medium før autoklavering..

Dextrose agar Sabouraud Emmons med cycloheximid

Cycloheximid stamopløsning

- Vægt 5 g cycloheximid

- Mål 100 ml acetone

- mix

Sabouraud dextrose agarmediet (Emmons) fremstilles som allerede beskrevet, og derudover tilsætes for hver liter medium 10 ml cycloheximid stamopløsning før autoklavering.

Sabouraud dextrose agar (Emmons) med chloramphenicol og cycloheximid

Sabouraud-agarmedium (Emmons) fremstilles som allerede beskrevet og længere pr liter medium tilsættes 10 ml chloramphenicol stamopløsning og 10 ml cycloheximid stamopløsning før autoklavering.

Andre antibiotika, der kan tilsættes

20.000 til 60.000 enheder penicillin pr. Liter medium.

30 mg streptomycin pr. Liter medium.

Begge bør inkorporeres efter autoklavering af mediet, lidt afkølet (50-55 ° C).

0,04 g neomycin pr. Liter medium.

0,04 g gentamicin pr. Liter medium.

Særlige overvejelser

For sikkerhed er foretrukne plante Sabouraud dextroseagar i kileformede rør (skrå fløjte peak) snarere end i petriskåle, at undgå spredning og inhalation af sporer.

Det er vigtigt, at rør med Sabouraud agar er dækket med bomuld og ikke med skruehætte, da det har vist sig, at semianaerobe tilstande hæmmer dannelsen af ​​sporer i nogle stammer, for eksempel Coccidioides immitis. Desuden er de fleste svampe aerob.

Hvis du bruger en skruehætte, skal du ikke lukke tæt.

Kvalitetskontrol

De forberedte medier skal have kvalitetskontrol for at kontrollere, at de fungerer korrekt. Til dette formål såres visse kontrolstammer.

For Sabouraud kan dextrose agar med chloramphenicol ATCC stammer anvendes. Candida albicans, som skal have god vækst. En anden plade inokuleres med stammer af Escherichia coli, skal hæmmes fuldstændigt.

En ikke-inokuleret plade inkuberes, hvor ingen mikroorganisme skal vokse.

Sabouraud dextrose agar med chloramphenicol og cycloheximid kan anvendes stammer af  Trichophyton mentagrophytes, skal udvikle sig godt. En anden plade inokuleres med en stamme af Aspergillus flavus, hvor der må være lille vækst eller ingen vækst. Derudover inkuberes en ikke-inokuleret plade for at demonstrere dens sterilitet.

For Sabouraud dextrose agar med cycloheximid, stammer af Candida albicans, Trichophyton rubrum  eller Microsporum canis, som skal vise god vækst.

Ligeledes en belastning af Aspergillus flavus, viser svag vækst eller ingen vækst. Til sidst inkuberer en ikke-inokuleret plade til sterilitetskontrol.

applikationer

Primær dyrkning

Classic Sabouraud dextrose agar indeholder 4 gram dextrose og er fremragende som et primært isolationsmedium, da det viser den karakteristiske morfologi af hver svamp.

Det er også fremragende at demonstrere produktionen af ​​pigmenter. Det er imidlertid ikke det mest hensigtsmæssige middel til at observere sporulation.

Det anbefales heller ikke at vokse Blastomyces dermatitidis, som hæmmes af den høje koncentration af glucose, der er til stede.

På den anden side skal der tages hensyn til visse overvejelser for dyrkning.

Nogle svampe udvikler sig bedre ved stuetemperatur, såsom forme, andre udvikler sig succesfuldt ved 37 ° C, ligesom nogle gærer, og andre kan udvikle sig ved begge temperaturer (dimorfe svampe).

Af denne grund er det nogle gange nødvendigt at anvende flere Sabouraud agarplader til den samme prøve, da de ofte plantes i to eksemplarer for at inkubere en plade ved stuetemperatur og en anden plade ved 37 ° C..

For eksempel, Sporothrix schenckii det er sået i to plader; den ene inkuberes ved stuetemperatur for at opnå formfasen, og den anden inkuberes ved 37 ° C for at opnå den gærlignende fase, men i sidstnævnte er det nødvendigt at tilsætte 5% blod til mediet.

I andre tilfælde, som i prøver af mycetomer, såres to plader af Sabouraud agar, en med chloramphenicol og den anden med cycloheximid. Den første vil tillade vækst af forårsagende midler af mycetom af svampeoprindelse (Eumicetoma) og det andet forårsagende middel af mycetomer af bakteriel oprindelse, såsom actinomycetomer..

sporulation

Dextrose Sabouraud agar modificeret af Emmons indeholder 2 gram dextrose og anvendes ikke kun til isolering, men også til sporulation og bevarelse af svampe.

I dette medie, hvis du kan genoprette stammer af Blastomyces dermatitidis.

bevaring

For at bevare svampekulturer kan opbevares i køleskab (2-8 ° C). Lagringstiden kan variere fra 2 til 8 uger. Efter denne tid skal de subcultureres for at gentage processen.

Nogle svampe opretholdes bedst ved stuetemperatur, som f.eks Epidermophyton foccosum, Trichophyton schoenleinnii, T. violaceum og Microsporum audounii.

Vedligeholdelsen af ​​stammen kan forlænges for at undgå pleomorfisme, hvis dextrose fjernes fuldstændigt fra agar og hvis mængden af ​​agar i mediet er nedsat for at undgå tørhed.

mikrokulturer

Til identifikation af nogle filamentøse svampe er det nødvendigt at udføre mikrokulturer ved brug af Sabouraud agar eller andre specielle midler til at observere strukturerne for seksuel og aseksuel reproduktion.

I human mykologi

Det anvendes hovedsagelig til diagnosticering af svampesygdomme, især dem der påvirker huden og dets vedhæftede stoffer (hår og negle).

Prøverne kan være sekreter, ekssudater, hud, hår, negle, sputum, CSF eller urin. Patogenerne, der er almindeligt isolerede, er dermatofytter, svampe, der forårsager subkutane og systemiske svampeinfektioner.

Dyre mykologi

Dyr er ofte påvirket af svampeinfektioner, så Sabouraud agar er lige så nyttigt hos dyr som i human mykologi..

For eksempel kan dermatofytter ofte påvirke dyr. Sådan er tilfældet med Microsporum canis var forvrænget, der ofte inficerer hunde, katte, heste, svin og aber. også, Microsporum gypseum inficerer hunde, katte og kvæg.

Fugle som kyllinger, roosters og kyllinger påvirkes af Microsporum gallinae.

Andre svampe, som Zymonema farciminosum, de er også en årsag til sygdom hos dyr, hovedsageligt i heste, muldyr og æsler, der producerer en vigtig betændelse i lymfekarrene.

Sporothrix schenkii og Histoplasma capsulatum påvirker husdyr og mennesker.

Miljømykologi

Mange patogene eller opportunistiske svampe kan koncentreres til enhver tid i et givent miljø, især i operationsrum og klinikker og hospitaler (Intensive Care Units). Derfor er det nødvendigt at kontrollere dem.

Andre sårbare rum er biblioteker og gamle bygninger, der kan påvirkes af koncentrationen af ​​miljøswampe.

I miljøstudier anvendes Sabouraud dextrose agar til isolering af svampe.

Industriel mykologi

Sabouraud dextrose agar kan ikke mangle til undersøgelse af svampeforurenende stoffer i produktionen af ​​kosmetik, mad, drikkevarer, læder, tekstiler, blandt andre.

Plant mykologi

Planterne lider også sygdomme forårsaget af svampe, der påvirker forskellige dele af planten, hvilket endda kan afslutte høsten og forårsage store tab i landbruget.

referencer

  1. Cuenca M, Gadea I, Martín E, Pemán J, Pontón J, Rodríguez (2006). Mikrobiologisk diagnose af mykoser og følsomhedsundersøgelser til antifungale stoffer. Anbefalinger fra det spanske selskab for smitsomme sygdomme og klinisk mikrobiologi. Tilgængelig på: coesant-seimc.org
  2. ValteK Laboratory. (2009). Sabouraud dextrose agar med cycloheximid. Tilgængelig på: andinamedica.com.
  3. Navarro O. (2013). Veterinær mykologi. National Agrarian University. Nicaragua.
  4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Mikrobiologisk diagnose af Bailey & Scott. 12 udg. Argentina. Panamericana S.A Editorial
  5. Casas-Rincon G. General Mycology. 1994. 2. udgave Universidad Central de Venezuela, Bibliotek udgaver. Venezuela, Caracas.