Endonukleaser funktioner og typer



den endonukleaser er enzymer, der skærer phosphodiesterbindingerne placeret i nukleotidkæden. Restriktionsstederne for endonukleaser er meget varierede. Nogle af disse enzymer skærer DNA (deoxyribonukleinsyre, vores genetiske materiale) næsten overalt, det vil sige de er uspecifikke.

Derimod er der en anden gruppe af endonukleaser, der er meget specifikke i regionen eller sekvensen, de skal punktafleje. Denne gruppe af enzymer er kendt som restriktionsenzymer, og de er meget nyttige i molekylærbiologi. I denne gruppe har vi de kendte enzymer Bam HI, Eco RI og Alu I.

I modsætning til endonukleaser er der en anden type katalytiske proteiner - exonukleaserne - der er ansvarlige for at bryde phosphodiester-forbindelsen i enden af ​​kæden.

indeks

  • 1 Restriktionsendonukleaser
  • 2 Funktioner og anvendelser af restriktionsendonukler
    • 2.1 Restriktionsfragmentlængde polymorfisme (RFLP)
  • 3 Typer af restriktionsendonukleaser
    • 3.1 Type I
    • 3.2 Type II
    • 3.3 Type III
    • 3.4 Type IV
  • 4 referencer

Restriktionsendonukleaser

Restriktionsendonukleaser eller restriktionsenzymer er katalytiske proteiner, der er ansvarlige for spaltning af phosphodiesterbindingerne inde i DNA-kæden i meget specifikke sekvenser.

Disse enzymer kan erhverves i flere bioteknologiske virksomheder, og deres anvendelse er næsten uundværlig inden for de nuværende DNA manipulationsteknikker.

Restriktionsendonukleaserne navngives ved anvendelse af de første bogstaver i det binomiale videnskabelige navn af organismen, hvorfra de kommer, efterfulgt af stammen (dette er valgfrit) og slutter med gruppen af ​​restriktionsenzymer, som de tilhører. For eksempel er BamHI og EcoRI anvendte endonucleaser.

Den region af DNA-enzymet anerkender kaldes et restriktionssted og er unik for hver endonuklease, selv om flere enzymer kan overlappe restriktionssteder. Dette site er sædvanligvis en kort palindromsekvens 4 til 6 basepar i længde, som AGCT (Alu I til) og EcoRI GAATTC.

Palindromiske sekvenser er sekvenser, der, selv om de læses i retningen 5 'til 3' eller 3 'til 5', er identiske. For eksempel i tilfælde af EcoRI er den palindromiske sekvens: GAATTC og CTTAAG.

Funktioner og anvendelser af restriktionsendonukler

Heldigvis har bakterier i molekylærbiologerne udviklet en række restriktionsendonukleaser, som internt fragmenterer det genetiske materiale.

I naturen har disse enzymer udviklet - formentlig - som et system til beskyttelse mod bakteriel invasion af fremmede DNA-molekyler, såsom fra fager.

For at diskriminere mellem det eget og fremmede genetiske materiale kan disse restriktionsendonucleaser genkende specifikke nukleotidsekvenser. Således kan DNA'et, der ikke har denne sekvens, være uforstyrret inde i bakterien.

I modsætning hertil, når endonukleasen genkender restriktionsstedet, binder den til DNA'et og skærer det.

Biologer er interesserede i at studere det levende materiale af levende væsener. DNA består dog af flere millioner basepar i længden. Disse molekyler er ekstremt lange og skal analyseres i små fragmenter.

For at opfylde dette mål integreres restriktionsendonukleaser i de forskellige molekylærbiologiske protokoller. For eksempel kan et individ gen fanges og replikeres til fremtidig analyse. Denne proces kaldes "kloning" et gen.

Restriktionsfragmentlængde polymorfisme (RFLP)

Restriktionsfragmentlængdepolymorfier refererer til mønsteret af specifikke nukleotidsekvenser i DNA'et, som restriktionsendonukleaser er i stand til at genkende og skære.

Takket være enzymets specificitet er hver organisme kendetegnet ved et specifikt snitmønster i DNA'et med oprindelses fragment af variable længder.

Typer af restriktionsendonukleaser

Historisk er restriktionsendonukleaser blevet klassificeret i tre typer af enzymer, udpeget med romertal. I det seneste er en fjerde type endonuklease blevet beskrevet.

Type I

Den vigtigste egenskab ved type I endonukleaser er, at de er proteiner dannet af flere underenheder. Hver af disse fungerer som et enkeltproteinkompleks og har normalt to underenheder kaldet R, to M og en S.

S-delen er ansvarlig for genkendelsen af ​​restriktionsstedet i DNA'et. R-underenheden er på den anden side afgørende for spaltning, og M er ansvarlig for katalysering af methyleringsreaktionen.

Der er fire underkategorier af type I enzymer, kendt under bogstaverne A, B, C og D, som er i almindelig brug. Denne klassificering er baseret på genetisk komplementering.

Type I-enzymer var de første restriktionsendonukleaser, der blev opdaget og oprenset. Imidlertid er de mest anvendelige i molekylærbiologi de af type II, der vil blive beskrevet i det næste afsnit.

Type II

Type II-restriktionsendonucleaser genkender specifikke DNA-sekvenser og udfører spaltning i en konstant position nær en sekvens, der producerer 5'-phosphater og 3'-hydroxyler. Magnesiumioner kræves normalt som cofaktorer (Mg2+), men der er nogle der har meget mere specifikke krav.

Strukturelt kan de fremstå som monomerer, dimerer eller endog tetramerer. Rekombinant teknologi bruger type II endonucleaser, og derfor er mere end 3.500 enzymer blevet karakteriseret.

Type III

Disse enzymsystemer består af to gener, kaldet mod og oksekød, som koder for underenheder, der genkender DNA og for ændringer eller restriktioner. Begge subunits er nødvendige for begrænsningen, en proces, der er helt afhængig af hydrolysen af ​​ATP.

For at spalte DNA-molekylet skal enzymet interagere med to kopier af den ikke-palindromiske genkendelsessekvens, og lokaliteterne skal være i omvendt orientering på substratet. Klyvningen foregår ved en translokation af DNA'et.

Type IV

En yderligere gruppe er blevet identificeret på det seneste. Systemet er sammensat af to eller flere gener, der koder for proteiner, der spalter kun modificerede DNA-sekvenser, det være sig methyleret, hydroxymethyleret eller hydrosyleret glycosyl.

For eksempel genkender enzymet EckKMcrBC to dinucleotider med den generelle form RmC; en purin efterfulgt af en methyleret cytosin, som kan adskilles af flere basepar - fra 40 til næsten 3000. Klyvningen finder sted omkring 30 basepar efter stedet, som enzymet genkender.

referencer

  1. Burrell, M. M. (Ed.). (1993). Enzymer af molekylærbiologi. Totowa, NJ: Humana Press.
  2. Loenen, W. A., Dryden, D.T., Raleigh, E.A., og Wilson, G.G. (2013). Type I restriktionsenzymer og deres slægtninge. Nukleinsyrer forskning, 42(1), 20-44.
  3. Murray, P.R., Rosenthal, K.S., & Pfaller, M.A. (2017). Medical Microbiology + StudentConsult på spansk + StudentConsult. Elsevier Health Sciences.
  4. Nathans, D., & Smith, H. O. (1975). Restriktionsendonukleaser i analysen og omstruktureringen af ​​DNA-molekyler. Årlig gennemgang af biokemi, 44(1), 273-293.
  5. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). Type II restriktionsendonukleaser: struktur og mekanisme. Cellular and molecular life sciences, 62(6), 685.