Gram pletfundament, materialer, teknik og anvendelser



den Gram plet Det er farvning teknik enklere og mere nyttige i diagnostisk mikrobiologi. Denne teknik blev skabt af den danske læge Christian Gram i 1884, som det lykkedes at klassificere bakterier i Gram positiv og Gram negativ, i henhold til sammensætningen af ​​cellevæggen.

Teknikken har lidt modifikationer af Hucker i 1921 for at stabilisere de anvendte reagenser og forbedre kvaliteten af ​​farvning, så Gram-farvning er også kendt som Gram-Hucker.

Med denne teknik er det også muligt at observere formularen, som mikroorganismer har, det vil sige, om de er cocci, baciller, coccobacilli, pleomorphic, filamentøse, blandt andre. Ud over dets fordeling i rummet: i klynge, i kæde, isoleret, parvis, i tetrader mv..

Når en bakteriel infektion mistænkes, skal de fleste af de modtagne prøver spredes på et dias og farves med Gram til undersøgelse under mikroskopet..

Gramens rapport vil lede lægen om, hvilken type mikroorganisme der kan være årsagen til infektionen, inden man opnår det endelige resultat af afgrøden.

I nogle tilfælde er patientens liv meget kompromitteret, så lægerne har akut brug for Gram-rapporten til at lægge en empirisk behandling, mens de venter på identifikationen af ​​mikroorganismen.

For eksempel, hvis Gram afslører der grampositive kokker i CSF, lægen styre den indledende antibiotikabehandling at eliminere disse typer af bakterier, ifølge protokoller, der er etableret for dette.

Når det endelige resultat ankommer med navnet på den isolerede mikroorganisme og dets respektive antibiogram, vil lægen vurdere, hvorvidt behandlingen skal ændres eller ej. Denne beslutning vil blive foretaget i henhold til undersøgelsen af ​​modtagelsen af ​​mikroorganismen til de antibiotika, som den modtager, og patientens udvikling.

indeks

  • 1 Foundation
  • 2 materialer
  • 3 Fremstilling af farvestoffer og reagenser
    • 3.1 Krystal violet løsning
    • 3.2 Iodo-Lugol
    • 3.3 Blegning
    • 3.4 Kontrast
  • 4 Opbevaring af reagenser
  • 5 Forberedelse af spredningen af ​​prøven, der skal farves
    • 5,1-gram direkte prøver
    • 5,2-gram afgrøder
  • 6 Teknik
  • 7 værktøj
  • 8 Almindelige fejl
  • 9 Referencer

fundament

Dette er en teknik, der præsenterer 4 grundlæggende trin: farvning, fiksering med mordant, misfarvning og kontratinktion. Derfor skelner denne teknik ud over at farve bakterierne også dem.

Krystalviolet farvestof anvendes først. Det har en affinitet for peptidoglycan og plet lilla alle bakterier derpå Lugol, som mordant, der er placeret, vil inducere dannelsen af ​​uopløselige komplekser af krystalviolet-iod - ribonuclear proteiner i cellen.

Gram-positive bakterier, der har en tyk mur af peptidoglycan, danner mere komplekser (krystalviolet-iod), derfor bevarer de farvestoffet.

Det påvirker også, at den Gram-positive bakterievæg indeholder en større mængde umættede syrer, som viser en høj affinitet for oxidationsmidler (Lugol).

I mellemtiden har gramnegative bakterier et tyndt lag peptidoglycan, hvilket gør bakterier mindre komplekse end gram-positive bakterier.

Derefter kommer skridtet med misfarvning, hvor Gram-positive og Gram-negative bakterier opfører sig anderledes.

Gramnegative bakterier indeholder en ydre membran rig på lipopolysaccharider, som er en del af sin cellevæg. Fedtstoffer ødelægges ved kontakt med alkoholaceton, så den ydre membran destabiliseres, den violette krystal frigives.

Sådan modvirkes det derefter med safranin eller basisk fuchsin, idet du tager farven rød.

I tilfælde af Gram-positive bakterier modstår de misfarvning, fordi blegemiddelet virker for at lukke porerne, hvilket forhindrer, at krystalviolet / iodkomplekset undslipper.

Farven med den violette krystal er derfor stabil, og der er ikke plads til safranin eller fuchsin. På grund af dette blokerer disse bakterier intens blå eller lilla.

materialer

Gramfarvesætet består af:

  • Violet krystal
  • Lugol
  • Acetonalkohol
  • Safranin eller basisk fuchsin

Fremstilling af farvestoffer og reagenser

Krystal violet løsning

Løsning A:

Violet krystal -2 gr

Ethylalkohol 95% -20cc

Opløsning B:

Ammoniumoxalat -0,8 gr

Destilleret vand-80 cc

Til den endelige fremstilling af den violette krystal skal 1:10 opløsningen fortyndes med destilleret vand og blandes med 4 dele opløsning B. Blandingen opbevares i 24 timer før brug. Den filtreres i en kolbe til ravfarvning ved hjælp af et papirfilter.

Mængden, som vil blive brugt dagligt, overføres til en gule flaske med dråber.

Iod-Lugol

Væg og måle den angivne mængde af hver forbindelse som følger:

Iodos krystaller - 1gr

Kaliumjodid - 2gr

Destilleret vand -300 cc

Kaliumiodidet opløses lidt efter lidt i vandet, og derefter tilsættes iod. Opløsningen er barberet til en gulfarvet flaske.

Mængden, som vil blive brugt dagligt, overføres til en mindre gule flaske med dråber.

blegning

95% ethylalkohol -50 ml

Aceton - 50 ml

Den er udarbejdet i lige dele. Cover godt, det har tendens til at fordampe.

Placer i en flaske med dråber.

Dette præparat giver en misfarvning i moderat tid 5-10 sekunder og er den mest anbefalede.

Begyndere foretrækker at bruge kun 95% ethylalkohol, hvor misfarvning er langsommere fra 10 til 30 sek.

Mens de mest erfarne kan bruge ren acetone, hvor misfarvning sker meget hurtigt fra 1 til 5 sek.

kontrast

Safranin stamopløsning

Safranina -2,5 gr

Ethylalkohol 95% -100 cc

Efter vejning opløses den angivne mængde safranin i 100 ml ethylalkohol til 95%.

Arbejdsløsningen af ​​safranin fremstilles ud fra stamopløsningen.

For at gøre dette måles 10 cc af stamopløsningen, tilsættes 90 cc destilleret vand for at fuldføre 100 ml.

Det anbefales at overføre det beløb, der vil blive brugt dagligt til en gule flaske med en dråber.

Mikroorganismer, der pletter svagt Gram-negativ med Gram-Hucker plet, såsom visse anaerober, Legionella sp, Campylobacter sp og Brucella sp, de kan være meget bedre farvede, hvis der anvendes modifikation foretaget af Kopeloff til Gram-Hucker-farvning, kaldet Gram-Kopeloff stain.

Denne teknik ændrer safraninfarvestoffet med basisfuchsin. Med denne modifikation er det muligt effektivt at farve de førnævnte mikroorganismer.

Opbevaring af reagenser

Forberedte farvestoffer skal opbevares ved stuetemperatur.

Forberedelse af prøve spredt til farve

En prøve skal indeholde mindst 105 mikroorganismer før observation af mikroorganismen i et smear er sandsynligt. Spreads kan fremstilles fra direkte prøve eller kulturer i fast eller flydende medier.

Spredninger skal være ensartede, godt fordelte og ikke for tykke til en bedre visualisering af de nuværende strukturer.

-Gram direkte prøver

Urin gram uden centrifuge

Urin blandes og 10 μl placeres på et dias. Observationen af ​​mindst et bakterie / Immersion-felt indikerer, at der er en infektion.

Dette betyder, at kulturen vil have ca. 100.000 CFU / ml (105 CFU / ml) urin i 85% af tilfældene.

Denne metode er ikke anvendelig til kolonitællinger under 100.000 CFU.

LCR Gram

CSF'en skal centrifugeres, supernatanten fjernes og pellet spredes på et dias. Denne væske er steril under normale forhold; observation af bakterier indikerer infektion.

Gram af åndedrætsprøver

Gram sputum, bronchial eller bronkoalveolær lavage, mens der kan være forskellige mikroorganismer, altid orientere i diagnose samt være anvendelige type celler observeret.

I tilfælde af sputum bør smeden fremstilles med de mest purulente dele af prøven.

Afføring Gram

Det anbefales ikke at udføre Gram til denne type prøver, da den ikke har nogen diagnostisk værdi.

-Gramafgrøder

De kan gøres på to måder, en fra flydende afgrøder og en anden fra faste afgrøder.

Flydende afgrøder

Fra flydende kulturer er meget enkel; under lighteren flere Brændt beskidt bouillon de er taget og anbragt på en ren, tør slides, hvilket giver en cirkulær bevægelse fra midten mod periferien, for at fordele materialet jævnt.

Det må tørre spontant i luften. Når det er tørt, fastgøres materialet til pladen med varme. Til dette ved hjælp af en klemme føres arket 3 4 gange gennem Bunsen-brænderens flamme, idet man sørger for ikke at brænde materialet.

Pladen får lov at afkøles og placeres på farvebroen.

Faste afgrøder

For at udføre en forlængelse for Gram-plet fra en fast kultur, fortsæt som følger:

Før valget af kolonierne skal tages, skal diaset udarbejdes, idet der placeres to dråber ca. af steril fysiologisk saltopløsning.

Hvis den oprindelige kulturplade indeholder flere forskellige typer af kolonier, vælges en isoleret koloni af hver for at udføre Gram. Hver koloni vil blive taget med platinsløjfen for at opløse den i saltvandsløsningen, der tidligere er anbragt på glideren.

Cirkulære bevægelser er givet fra midten til periferien for at fordele kolonien ensartet på diaset..

Det må tørre spontant i luften. Efter tørring er pladen fastgjort med varme som forklaret ovenfor (flammende glideren med lighteren), idet du er forsigtig med ikke at brænde materialet.

Denne procedure skal udføres med hver anden type koloni. På et stykke papir skal rækkefølgen af ​​de observerede noteres, for eksempel:

Koloni 1: Gul beta-hæmolytisk koloni: Grampositive kokhunde blev observeret i klynger

Koloni 2: Kremkoloni uden hæmolyse: Gram-negativ coccobacilli blev observeret.

Hvert ark skal mærkes for at vide, hvad vi observerer.

teknik

Gramfarvningsteknik er ekstremt nem at udføre og forholdsvis billigt og kan ikke gå glip af i et mikrobiologisk laboratorium.

Det samme gøres som følger:

  1. Fix smøret med varme og placér på den farvede bro.
  2. Pladen er helt dækket med violet glas i 1 minut.
  3. Vask med vand. Må ikke tørre
  4. Dæk pladen med Lugol opløsning, lad i 1 minut. Vask med vand. Må ikke tørre.
  5. Bland i 5-10 sekunder med forsigtig omrøring i acetonealkohol. Eller læg arket i opretstående stilling og slip dråberne af affarvningsmidlet på overfladen, indtil det resterende violette glas trækkes væk. Må ikke overstige.
  6. Vask med vand. Må ikke tørre.
  7. Udskift arket på den farvede bro og dække i 30 sek med safranin (Gram-Hucker) eller 1 min med basisk fuchsin (Gram-Kopeloff).
  8. Vask med vand
  9. Lad tørre spontant i lodret luft.

Når først det er tørt, anbring 1 dråbe nedsænkningsolie for at observere det under målet om 100X i det optiske mikroskop.

nytte

Denne teknik gør det muligt at skelne mellem de fleste bakterier i morpotypeintiale forskelle.

Gær er også kendetegnet ved denne farve. De tager krystal violet, det vil sige, de pletter Gram positive.

På den anden side kan Gram-positive sporeformende baciller skelnes, hvor der ses et klart rum inde i bacillus, hvor endosporerne blev dannet, selvom sporerne ikke pletter godt. Til brug af sporer anvendes andre teknikker som Shaeffer-Fulton.

Det skal bemærkes, at denne plet ikke tjener til at farve alle typer bakterier, det vil sige der er tilfælde, hvor farvningen ikke virker.

I dette tilfælde kan bakterier, der mangler en cellevæg, nævnes. For eksempel: slægten Mycoplasma, sfæroplaster, Ureaplasma, L-former og protoplaster.

Det pletter også dårligt bakterier med vægge rig på mycolic syrer, såsom Mycobacteria og intracellulære bakterier som Chlamydias og Rickettsias.

Det er også ineffektivt at plette de fleste spirochetalbakterier.

Der er bakterier af samme genus, der kan observeres i samme prøve som Gram-positiv og som Gram-negativ. Når dette sker, kaldes det variabel Gram-plet, hvilket kan skyldes ændring i næringsstoffer, temperatur, pH eller koncentration af elektrolytter..

Almindelige fejl

Blegemiddel overdrevent

Overdrivning i misfarvningstrinnet kan medføre observation af falske gram-negative mikroorganismer.

Vent ikke på tilstrækkelig tørretid for at tilsætte nedsænkningsolien:

Denne fejl forårsager dannelsen af ​​fede miceller, der gør det vanskeligt at observere strukturerne til stede. Dette sker, når olien slutter sig til de vandmolekyler, der er til stede i smøret.

Omvendt rækkefølgen af ​​reagenserne:

En fejl som dette vil medføre, at gram-negative bakterier viser lilla, det vil sige falsk gram-positiv.

Brug gamle afgrøder (fast eller flydende):

Det kan forårsage Gram-positive bakterier til at plette gram negative (falsk gram negativ). Dette sker fordi i de gamle kulturer det er sandsynligt, at der er døde eller forringede bakterier, og under disse betingelser bevarer bakterierne ikke den violete krystal.

Brug meget gammel Lugol opløsning:

Over tid mister lugol sine egenskaber og farven falder. Hvis det allerede degenererede reagens anvendes, vil det ikke rette kristallviolen godt, derfor er der mulighed for at opnå en visualisering af mikroorganismer falsk gramnegativ.

Bluish baggrund

En korrekt misfarvet baggrund vil være rød. En blå baggrund angiver, at misfarvningen ikke var tilstrækkelig.

referencer

  1. Ryan KJ, Ray C. 2010. sherris. mikrobiologi Medicinsk, 6. udgave McGraw-Hill, New York, USA
  2. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnose. (5. udgave). Argentina, Editorial Panamericana S.A..
  3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Mikrobiologisk diagnose af Bailey & Scott. 12 udg. Argentina. Panamericana S.A Editorial
  4. Casas-Rincón G. 1994. General Mycology. 2. udgave Universidad Central de Venezuela, Bibliotek udgaver. Venezuela, Caracas.
  5. "Gram stain" Wikipedia, Den frie encyklopædi. 4. oktober 2018, 23:40 UTC. 9. december 2018, 17:11. Modtaget fra es.wikipedia.org.
  6. González M, González N. 2011. Manual of Medical Microbiology. 2. udgave, Venezuela: Direktoratet for medier og publikationer fra University of Carabobo.
  7. Lopez-Jácome L, Hernandez-Durán M, C colin-Castro, Pena-Ortega S, G Ceron-González, F. Franco-Cendejas Basiske farvestoffer i mikrobiologiske laboratorium. Forskning om handicap. 2014, 3 (1): 10-18.