Wrights pletfundament, materialer, teknik og anvendelser



den Wrigths plet er en farveteknik skabt af den amerikanske patolog James Homer Wright i 1902, fra Romanowskys plet. Da Romanowskys farvning var ustabil, indarbejdede Wrigth methanol som opløsningsmiddel og fixativ.

Denne farve er polychromatisk, hvilket betyder, at det genererer flere farver afhængigt af den struktur, som farvestoffet absorberer. Denne farvning teknik har været udbredt anvendt til differentielle hvide blodlegemer og studere morfologi røde blodlegemer, blodplader og leukocytter i perifert blod og knoglemarv.

Anvendelsen er meget vigtig, da abnormiteter kan ses i blodets forskellige cellelinier, hvilket letter diagnosen sygdomme som leukæmi eller bakterielle eller parasitære infektioner.

Måske er disse de mest almindelige anvendelser, hvor denne teknik anvendes, men de er ikke de eneste. Det er også nyttigt i andre prøver end blod og knoglemarv, såsom prøver af nasal udtømning, fækal slim, sputum, hud, blandt andre..

indeks

  • 1 Foundation of Wrights plet
  • 2 materialer
    • 2.1 Fremstilling
    • 2,2 bufferbufferopløsning
    • 2.3 Yderligere materialer, der er nødvendige for at udføre farvningen
  • 3 komponenter af Wrights plet
    • 3.1 methanol
    • 3.2 Støddæmperen
    • 3.3 Eosin (Y)
    • 3.4 Methylenblå
  • 4 Teknik
  • 5 værktøj
    • 5.1 Hematologi
    • 5.2 Nasal Sekretion
    • 5.3 Parasitologi
    • 5.4 Luftvejsinfektioner
    • 5.5 Bakteriologi
    • 5.6 Mykologi
  • 6 Hvordan ses strukturerne af blodprøven observeret med Wrights plet??
  • 7 Anbefalinger til god farvning
  • 8 Almindelige fejl i Wrigth-farvning
    • 8.1 Meget svagt farvning
    • 8.2 Præcipitater af farvestoffet
    • 8.3 Smør med ekstremt rødlig eller blå farve
  • 9 Opbevaringstilstand
  • 10 referencer

Wrights pletfundament

Wright farvning født Romanowsky-farvning, der består af en opløsning af methylalkohol en syre farvestof (Eosin Y) og en basisk (methylenblåt) og deres oxidationsprodukter.

Farvestofblandingen anvendes i Wright farvning har den virkning, der kaldes Romanowsky-, dvs. giver en smuk purpurfarvning mod kernerne i leukocytter og neutrofile granula, mens de røde blodlegemer er farves pink.

Komponenterne er ansvarlige for at give det typiske farver Wright farvning er blå B og eosin Y. observerede virkning afhænger af bindingen af ​​farvestoffer til de kemiske strukturer og interaktioner af blå B og Eosin Y.

Syre strukturer som nukleinsyrer, nukleare proteiner og reaktive umodne cytoplasmer af nogle celletyper, fixer blå B (basisk farvestof).

Mens de grundlæggende strukturer såsom hæmoglobin, korrigerer granulerne af de segmenterede eosinofiler, blandt andre cellulære strukturer, eosin Y (surt farvestof).

Resultatet af farvning kan påvirkes af forskellige faktorer, såsom pH af Wright-farvestoffet, bufferen og vaskeopløsningen; såvel som farvnings- og fastgørelsestiden.

Derfor er hvert trin i fremstillingen af ​​reagenserne afgørende og skal gøres ved at tage sig af alle detaljer.

materialer

Wright farvning. For 100 ml er det påkrævet:

Vejer 0,3 g Wright-farvestof, måler 97 ml methanol og 3 ml glycerol.

forberedelse

I en mørtel skal du placere den store mængde Wrights farvestof og langsomt tilsæt glycerolet, indtil pulveret er helt opløst..

Derefter tilsættes methanolet, blandes og hældes i en ravflaske.

Før brug af opløsningen skal rystes med blide bevægelser og filter.

Buffer buffer

I en liter destilleret vand blev 3,76 g dinatriumhydrophosphat (Na2HPO4   2H20) plus 2,1 g kaliumdihydrogenphosphat (KH)2PO4).

Bland godt sammen, indtil alle de indarbejdede reagenser er opløst. Indstil pH til 7.2. Hæld i en glasburk og hold den ved stuetemperatur.

Yderligere materialer er nødvendige for at udføre farvningen

ark næsestykke eller dækglas, bro farvestoffer pisetas med vand eller puffer til vask, en timer til at bære farvningsresultaterne tider og et tørrende materiale: derudover andre materialer til at udføre farvningsteknik, disse er påkrævet (absorberende papir, gasbind eller bomuld).

Wright-farveskomponenter

methanol

Alkohol (methanol) tjener som et fikseringsmiddel til blodsprøjten til diaset.

Dybest set er det et reducerende reagens, dehydrator og koaguleringsfixativ. Derfor er dens funktion at koagulere proteinerne og gøre dem uopløselige, men uden at få dematurere dem.

Methanol er det mest anvendte reagens til at klare smørefedt i alle laboratorier, da det giver bedre resultater end dem, der opnås med ethanol. Den ideelle koncentration er 99%.

Støddæmperen

Bufferen (bufferet opløsning) har funktionen til at justere eller opretholde farvestoffets pH, da en pH justeret til 7.2 er afgørende for cellestrukturer til at absorbere farvestoffer korrekt.

På den anden side dehydrerer passagen af ​​methanolfiksering cellerne, og bufferen hjælper med at rehydrere dem.

Eosin (Y)

Eosin har en affinitet for basiske komponenter, fordi det er et syrefarvestof. To typer eosin ligner hinanden meget, så hver af de to kan bruges, hvilket giver samme resultat.

Den ene kaldes eosin Y, eosin gul eller tetrabrom og andre eosin B, erythrosin B eller dibromodinitrofluoresceína blå. Eosin Y er dog den mest almindeligt anvendte.

Den vigtigste egenskab af dette farvestof er dens negative polaritet, hvilket gør det tiltrukket af cellulære strukturer med positiv ladning.

Methylenblå

Det er den grundlæggende farve. Dens hovedegenskab er metakromasi, det vil sige, ikke alle strukturer skal farves i samme farve, det afhænger af den kemiske sammensætning af strukturerne, at den farve.

Nogle vil blive lys eller mørkeblå og andre mørke lilla eller blege lilla.

teknik

1 - Udfør spredningen af ​​prøven, således at der forbliver en tynd film, enten på et dias eller en dækslip.

2-Lad lufttørre i ca. 2 timer.

3-Placer tørt smøremiddel på farvelægningen eller farveskuffen med prøven spredt opad.

4-Dæk arket med Wright-farvestoffet drop-by-drop, indtil det dækker hele overfladen. Lad være i 5 - 8 minutter.

5-Farvestoffet skal helt dække diaset, uden at du spilder over kanterne. Hvis der i farvningstiden begynder at fordampe, skal yderligere dråber anbringes.

6-Efterfølgende tilføj en tilsvarende mængde af støddæmperen, blæs lidt, indtil den karakteristiske metalliske glans vises. Tag 10 til 15 minutter.

7-Vask med ledningsvand, læg den bløde stråle, indtil arket ser rosa ud.

8 - Med en gasbind imprægneret med alkohol fjernes farvestoffet fastgjort til bagsiden af ​​lysbilledet.

9-Lad smøremidlet tørre meget godt, før du sætter nedsænkningsolien for at visualisere det i mikroskopet.

nytte

hæmatologi

Det er ideelt til smøring af perifere blodudsmid, til undersøgelse af tykke blodudsmud og til undersøgelse af celler fra knoglemarvsprøver.

På grund af de kemiske egenskaber ved denne kombination af farvestoffer kan de cellulære strukturer let genkendes, idet de kan skelne de forskellige typer celler til stede.

Nasal sekretion

Denne teknik er meget nyttig til at identificere cellerne i nasal sekretionen (epithelceller, segmenterede eosinofiler, polymorfonukleære) ved diagnosen allergisk rhinitis.

parasitologi

I den forstand har det været nyttigt for undersøgelsen af Leishmania sp inden for histiocytterne af det subkutane cellulære væv i hudsåre. På samme måde bruges det til at identificere leukocytter i afføringprøver (fækalt leukogram).

I dette tilfælde er det af interesse for lægen at vide, om leukocytosen til stede i fæces er ved polymorfonukleær eller mononukleær. Denne opdagelse i fækal leucogrammet vil lede, hvis det er henholdsvis en bakteriel eller viral infektion.

På den anden side kan parasitterne, der cirkulerer i blodet, findes inden for erythrocyten eller frit i plasmaet. De ønskede parasitter er Plasmodium spp, Trypanosoma cruzii og filarias, og i veterinærmedicin er det nyttigt i søgen efter Theileria equi og Babesia caballi, Causative agenter af babyer, især i heste.

Wright og Giemsa plet kan differentiere hemoparasitter fra normale cellulære komponenter. Til dette kan du bruge to typer spred:

Fine strækninger

Blodet spredes som en tynd film på et dias. Farvet med Wrights plet, der afslører egenskaberne af kernen og cytoplasmaet.

Tykt fald

Denne metode bruges til at undersøge tilstedeværelsen af ​​parasitter i en større mængde blod.

Hertil kommer en stor dråbe blod på et dias. Når du er der, skal du defibrinere, hvilket gør større og større cirkler fra midten udad, ved hjælp af kanten af ​​et andet objektglas.

Endelig skal erythrocytterne lyseres med vand for at observere parasitterne i det tykke smear.

Respiratoriske infektioner

På respiratorisk niveau er denne teknik også nyttig, fordi cellerne til stede i sputumprøver, bronchial eller bronchoalveolær skylning er vigtige for at etablere diagnosen.

På samme måde kan polymorfonukleære celler og mononukleære celler skelnes her.

bakteriologi

Brugen af ​​denne teknik i bakteriologi er begrænset, fordi det ikke er godt for farvning af bakterierne, derfor bruges der for farvning af andre specialiserede farvestoffer.

Det har imidlertid været vant til at lede efter epitelceller med inklusionslegemer af Chlamydia trachomatis i udtværinger af urethral eller endocervical slimhinde, selvom det må erkendes, at det ikke er den bedste metode til dette.

Det er også muligt at observere spiral-type bakterier blandt de røde blodlegemer som Borrelia burgdorferi hos inficerede patienter samt morulae eller inklusionslegemer af Ehrlichia sp i cytoplasmaet af lymfocytter, monocytter eller neutrofiler i et blodsprøjt.

mycology

den Histoplasma capsulatum er en patogen svamp ofte diagnosticeres ved mikroskopisk observation af flere vævsprøver, farvet med Wright farvning.

Hvordan observeres strukturerne af blodprøven med Wrights plet?

Anbefalinger til god farvning

Udvidelser af blodprøver skal lufttørres spontant. Smørene skal være så tynde som muligt for at opnå en bedre fiksering af farvestoffet og undgå overkolleringer.

Ved farvning af høj kvalitet anbefales det at udføre farvningen i løbet af de to timer, der følger efter smøringen. På den anden side er den ideelle prøve kapillært blod uden antikoagulant.

Hvis der imidlertid anvendes veneblod bør anvendes som et antikoagulerende EDTA og heparin gjorde ikke, eftersom sidstnævnte kan deformere cellulære strukturer.

For at forhindre forringelse af det forberedte farvestof skal opbevares på tørre steder.

Under vaskeprocessen anbefales brug af vand justeret til neutral pH.

Endelig er det tilrådeligt at teste de farvningsmetoder, der anvendes i laboratoriet, så ofte.

Dette gøres ved farvning af prøver eller udvidede mønstre som kvalitetskontrol. Dette trin er vigtigt, da dette sikrer, at farvningen er ordentligt forberedt og farvetiderne er godt standardiserede.

Hvis mønsterarket er dårligt farvet, er der problemer, der skal løses.

Almindelige fejl i Wrigth farve

Meget bleg farvning

Meget blege udsmykninger, som regel på grund af meget kort tid med farvning eller en meget overdreven vask. Det korrigeres ved at forlænge kontakttiden med farvestoffet eller ved at nedsætte vasketiden.

Farve præcipiterer

Udfældningen farvestof udtværing kan have flere årsager, men de hyppigste årsager er: brug af farvestof ufiltreret farvestof på broer farve ujævn, under anvendelse beskidte ark med støv eller fedt, gøre en god vask den Afslut farvningen.

Smøre med ekstremt rødlig eller blå farve

Bufferen er ansvarlig for pH-værdien af ​​farvestoffet. Farvestoffer med pH under den angivne (sure) vil resultere i meget røde udtværinger.

Hvis farvestoffets pH er over (alkalisk), opnås et ekstremt blåagtigt smear.

Opbevaringstilstand

Reagenset skal opbevares ved stuetemperatur.

referencer

  1. V. Gutierrez Sammenlignende undersøgelse mellem Wright farvning metode og Elisa-test til diagnose af hunde ehrlichiosis i byen San Pedro Sula, Honduras. 2008. Afhandling til ansøgning om titel af dyrlæge. Universitetet i San Carlos de Guatemala.
  2. Lopez-Jácome L, Hernandez-Durán M, C colin-Castro, Pena-Ortega S, G Ceron-González, F. Franco-Cendejas Basiske farvestoffer i mikrobiologiske laboratorium. Forskning om handicap. 2014, 3 (1): 10-18.
  3. "Wrights plet." Wikipedia, Den frie encyklopædi. 18. maj 2018, 12:05 UTC. 8. december 2018, 20:37
  4. Calderón A, Cardona J, Vergara Ó. Frekvens af Babesia spp. i heste af montería, Córdoba (Colombia). Rev. udcaactual divulg cient.  2013; 16 (2): 451-458.
  5. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Mikrobiologisk diagnose af Bailey & Scott. 12 udg. Argentina. Panamericana S.A Editorial.
  6. Retamales E, Mazo V. Folkesundhedsinstitutets regering i Chile. Anbefalinger til farvning af blodudslæt til læsning af blodtællingen.